本文關(guān)鍵詞：高頻rTMS改善老齡相關(guān)認(rèn)知障礙的突觸可塑性機(jī)制及相關(guān)代謝物變化

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【摘要】：腦老化是老齡最重要的生理改變,也是阿爾茨海默病(AD)等多種神經(jīng)退行性疾病的重要危險(xiǎn)因素。目前對(duì)已確診的AD患者尚無有效的逆轉(zhuǎn)的方法,因此研究如何在早期延緩腦老化、改善認(rèn)知功能對(duì)防治AD等老年期癡呆具有重要的醫(yī)學(xué)及社會(huì)意義。與AD相比,老齡相關(guān)認(rèn)知障礙(Aging associated cognitive impairment,AACI)以腦組織功能改變?yōu)橹?而未達(dá)到神經(jīng)元死亡等病理狀態(tài)。有研究證實(shí)老年人的認(rèn)知能力具有一定的可塑性;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí),在正常老化過程中海馬及顳葉皮層仍然具有突觸可塑性。老齡腦神經(jīng)元及突觸具有的可塑性及再可塑性機(jī)制,使得處于老齡狀態(tài)下的大腦,仍具有對(duì)外來干預(yù)的有效響應(yīng)能力。海馬是學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要腦區(qū),海馬萎縮是老年癡呆的重要病理表現(xiàn)。相對(duì)結(jié)構(gòu)改變而言,老齡狀態(tài)下海馬及其不同亞區(qū)功能狀態(tài)的失調(diào)是AACI的主要原因。采取措施對(duì)老齡腦認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)的功能進(jìn)行干預(yù),完全有可能延緩認(rèn)知障礙的發(fā)生。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(Repetitive transcranial magnetic stimulation,r TMS)是一種安全、無創(chuàng)、價(jià)廉的顱外刺激方法,通過調(diào)節(jié)刺激頻率、刺激強(qiáng)度等參數(shù),可以影響神經(jīng)元活性,改善腦功能,從而發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。目前r TMS在臨床主要用于神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病的治療,可以改善此類疾病的相關(guān)癥狀,如改善抑郁程度,減輕帕金森病相關(guān)非運(yùn)動(dòng)癥狀,調(diào)節(jié)阿爾茲海默病人的認(rèn)知功能。有研究表明,長(zhǎng)期高頻r TMS還可以抑制正常老化過程中的認(rèn)知功能損傷。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(r TMS)對(duì)個(gè)體認(rèn)知功能的提高是通過網(wǎng)絡(luò)化、多通路的方式改善腦組織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮作用的。關(guān)于基因、蛋白、代謝產(chǎn)物的研究表明r TMS可以通過改善神經(jīng)元可塑性相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)以及代謝產(chǎn)物保護(hù)神經(jīng)元,進(jìn)而改善認(rèn)知功能。一般認(rèn)為低頻刺激有抑制神經(jīng)元興奮性的作用而高頻刺激有興奮作用。已有研究提出r TMS的作用具有狀態(tài)依賴性,在老齡腦這一特殊的背景下,高頻r TMS能否發(fā)揮同樣的正向作用?r TMS在影響老齡腦認(rèn)知功能,調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性所涉及的具體作用機(jī)制尚待探討。后基因組時(shí)代強(qiáng)調(diào)從整體上研究生物體的功能。應(yīng)用生物體體液和組織對(duì)機(jī)體病理機(jī)制進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè),并結(jié)合非靶標(biāo)多元統(tǒng)計(jì)分析方法,可以發(fā)現(xiàn)在疾病預(yù)防和治療過程中機(jī)體生化改變的標(biāo)志性物質(zhì)。氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(Gas chromatography-time of flight-mass spectrometry,GC-TOF-MS)具有檢測(cè)靈敏度高,可重復(fù)性的特點(diǎn),是目前研究代謝組學(xué)常用的的分析工具。已有的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)正常老齡腦的代謝譜與成年對(duì)照人員相比發(fā)生了明顯變化。r TMS干預(yù)后的老齡腦代謝譜如何變化、是否存在于認(rèn)知相關(guān)的代謝產(chǎn)物變化,尚無明確報(bào)道。嚙齒類動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,與人腦老化及老化相關(guān)的認(rèn)知功能障礙具有很多相似性。研究顯示老齡昆明小鼠可表現(xiàn)出認(rèn)知功能的損傷,伴有海馬和前額皮層突觸結(jié)構(gòu)和功能的變化,是研究正常腦老化的非常適合的動(dòng)物模型。新異物體識(shí)別和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),作為經(jīng)典的測(cè)量海馬相關(guān)學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)方法,可以用于對(duì)小鼠進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)估。本研究選取老齡昆明小鼠給予兩種不同頻率高頻r TMS處理,通過動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其認(rèn)知相關(guān)行為表現(xiàn),觀察高頻r TMS對(duì)老齡鼠認(rèn)知功能是否有改善;采用透射電鏡法觀察海馬區(qū)腦組織及突觸超微結(jié)構(gòu)的改變,通過PCR array及免疫印跡技術(shù)觀察海馬突觸可塑性相關(guān)基因及蛋白水平的變化,分析其相互作用關(guān)系,探討高頻r TMS是否影響老齡腦突觸結(jié)構(gòu)及功能可塑性;應(yīng)用GC-TOF-MS結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析和主成分分析方法測(cè)定小鼠腦組織代謝產(chǎn)物,探討高頻r TMS是否影響腦組織認(rèn)知相關(guān)代謝水平,進(jìn)一步尋找可能的認(rèn)知相關(guān)代謝標(biāo)志物。為進(jìn)一步在老年人群中應(yīng)用高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激作為延緩腦老化的早期干預(yù)手段提供理論依據(jù)。第一部分高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激改善小鼠老齡相關(guān)認(rèn)知功能障礙目的:觀察高頻r TMS是否能夠改善老齡昆明小鼠的認(rèn)知行為,證明高頻r TMS對(duì)老齡腦認(rèn)知功能的影響。方法:動(dòng)物分組及方法:3月齡及15月齡雄性昆明小鼠,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,分籠在實(shí)驗(yàn)室恒溫20-25攝氏度飼養(yǎng),室內(nèi)明暗周期12h/12h,自由飲食。通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)先對(duì)15月齡小鼠進(jìn)行認(rèn)知能力評(píng)價(jià),然后依據(jù)認(rèn)知成績(jī)隨機(jī)分配入老齡sham組及兩磁刺激組,確保三組小鼠起始認(rèn)知水平相當(dāng)。依照不同磁刺激方案,小鼠共分為以下4組進(jìn)行r TMS干預(yù):(1)青年sham組:3月齡昆明小鼠30只,將磁刺激線圈置于小鼠顱頂上方,不接觸顱頂,以磁頭反面進(jìn)行與r TMS組相同的操作。(2)老齡sham組:15月齡昆明小鼠30只,將磁刺激線圈置于小鼠顱頂上方,不接觸顱頂,以磁頭反面進(jìn)行與r TMS組相同的操作。(3)5Hz r TMS組:15月齡昆明小鼠30只,MCF-b65型8字線圈置于小鼠顱頂上方,不接觸顱頂,進(jìn)行每天10串頻率為5Hz的磁刺激,總共1000個(gè)脈沖,刺激強(qiáng)度為20%最大輸出強(qiáng)度;連續(xù)14天。(4)25Hz r TMS組:15月齡昆明小鼠30只,MCF-b65型8字線圈置于小鼠顱頂上方,不接觸顱頂,進(jìn)行每天10串頻率為25Hz的磁刺激,總共1000個(gè)脈沖,刺激強(qiáng)度為20%最大輸出強(qiáng)度;連續(xù)14天。磁刺激后觀察小鼠自主活動(dòng),并進(jìn)行新異物體識(shí)別(NOR)及Morris水迷宮(MWM)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)小鼠認(rèn)知行為。結(jié)果:1 r TMS對(duì)小鼠自主活動(dòng)行為無影響正常老齡鼠自發(fā)活動(dòng)比青年鼠減少;不同頻率老齡r TMS組與老齡sham組比較,自主活動(dòng)次數(shù)均無顯著差異,提示本實(shí)驗(yàn)所采用的高頻磁刺激方案對(duì)老齡鼠自發(fā)活動(dòng)無影響,具有安全性。2 r TMS顯著改善小鼠非空間記憶能力2.1老齡鼠非空間記憶能力降低r TMS干預(yù)前,NOR訓(xùn)練后1 h,與青年sham組相比,老年sham組認(rèn)知指數(shù)(Discriination index,DI)顯著下降(P0.05);老齡各組之間無顯著差異。訓(xùn)練后24 h時(shí)間點(diǎn),與青年sham組相比,老年sham組DI顯著下降(P0.05);老齡各組之間無顯著差異。2.2 r TMS顯著改善老年小鼠非空間記憶能力r TMS干預(yù)后,NOR訓(xùn)練后1 h,與老年sham組比較,5Hz及25Hz r TMS組小鼠DI指數(shù)均顯著提高(P0.05)。在訓(xùn)練后24 h時(shí)間點(diǎn),與老年sham組比較,僅5Hz r TMS組小鼠DI指數(shù)顯著提高(P0.05),提示5Hz r TMS干預(yù)在改善近時(shí)及遠(yuǎn)時(shí)記憶方面均有作用,25Hz r TMS干預(yù)僅對(duì)近時(shí)記憶有明顯改善作用。兩時(shí)間點(diǎn)5Hz及25Hz r TMS組作用組間相比較均無顯著差異。3 r TMS顯著改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)顯示:與老齡sham組相比,青年sham組小鼠平均尋臺(tái)潛伏期縮短,差異有顯著性(P0.05)。與老齡sham組相比,兩r TMS組平均尋臺(tái)潛伏期均縮短,5Hz組比25Hz r TMS組差異更具有顯著性(P0.01)�？臻g探索實(shí)驗(yàn)顯示,與青年sham組相比,老齡sham組小鼠原平臺(tái)所在象限探索距離百分比及穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P0.05);與老齡sham組相比,5Hz r TMS組在原平臺(tái)所在象限探索距離百分比顯著增加,5Hz及25Hz r TMS組小鼠穿越原平臺(tái)所在位置次數(shù)均有顯著增加(P0.05)。以上結(jié)果顯示,與青年鼠相比,老齡鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力顯著下降;5Hz r TMS干預(yù)及25Hz r TMS干預(yù)在改善老齡鼠空間學(xué)習(xí)記憶方面均有作用,但5Hz r TMS干預(yù)組比25Hz r TMS組表現(xiàn)出更好的學(xué)習(xí)記憶能力,提示5Hz r TMS干預(yù)的作用可能優(yōu)于25Hz r TMS干預(yù)。第二部分高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激改善老齡鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)可塑性目的:從神經(jīng)元及突觸結(jié)構(gòu)可塑性方面探討高頻r TMS改善老齡小鼠認(rèn)知功能障礙的可能機(jī)制。方法:選取第一部分15月齡昆明小鼠,每組18只用于本部分實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)sham組:15月齡昆明小鼠18只,將磁刺激線圈置于小鼠顱頂上方,不接觸顱頂,以磁頭反面進(jìn)行與r TMS組相同的操作。(2)5Hz r TMS組:15月齡昆明小鼠18只,MCF-b65型8字線圈置于小鼠顱頂上方,不接觸顱頂,進(jìn)行每天10串頻率為5Hz的磁刺激,總共1000個(gè)脈沖,刺激強(qiáng)度為20%最大輸出強(qiáng)度;連續(xù)14天。(3)25 Hz r TMS組:15月齡昆明小鼠18只,MCF-b65型8字線圈置于小鼠顱頂上方,不接觸顱頂,進(jìn)行每天10串頻率為25Hz的磁刺激,總共1000個(gè)脈沖,刺激強(qiáng)度為20%最大輸出強(qiáng)度;連續(xù)14天。磁刺激干預(yù)結(jié)束后,分別于刺激后1天(NOR實(shí)驗(yàn)后)及7天(MWM實(shí)驗(yàn)后)將小鼠處死,取海馬組織,通過透射電鏡法,觀察r TMS對(duì)海馬神經(jīng)元及突觸超微結(jié)構(gòu)的影響;以Western blotting法檢測(cè)神經(jīng)元前體標(biāo)志物及突觸前、后膜標(biāo)志蛋白的變化。結(jié)果:1 r TMS可以影響老齡狀態(tài)下神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)形態(tài)及突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)變化1.1神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化r TMS刺激7天,sham組,5Hz r TMS組及25Hz r TMS組小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)均可見:胞膜較完整,胞質(zhì)基質(zhì)分布較均勻,胞核和核膜結(jié)構(gòu)較完整,未達(dá)到AD所具有的典型的病理表現(xiàn),但細(xì)胞內(nèi)均不同程度地出現(xiàn)脂褐素沉積,5Hz及25Hz r TMS組脂褐素沉積出現(xiàn)幾率及沉積物大小較sham組有下降趨勢(shì),5Hz r TMS組較25Hz r TMS組降低更明顯。此外,Sham組可見線粒體形態(tài)僵硬,嵴膜融合,部分高爾基體模糊,核糖體數(shù)目減少;5Hz r TMS組及25Hz r TMS組線粒體內(nèi)外膜和線粒體嵴清晰可見,形態(tài)飽滿。提示高頻r TMS對(duì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)形態(tài)有一定影響,推論r TMS可能改善線粒體相關(guān)的細(xì)胞脂質(zhì)代謝及能量代謝過程。1.2突觸參數(shù)變化選取典型的Gray I型突觸計(jì)數(shù)突觸后致密物(PSD)厚度(nm)、突觸間隙寬度(nm)、突觸曲率及穿孔突觸數(shù)。r TMS后1天的數(shù)據(jù)顯示:與Sham組比較,5Hz r TMS組穿孔突觸比率顯著增加、突觸間隙寬度顯著下降,突觸曲率顯著增加;25Hz r TMS組PSD厚度顯著增加(P0.05)。r TMS后7天數(shù)據(jù)顯示:與Sham組比較,5Hz r TMS組PSD厚度顯著增加、突觸間隙寬度顯著下降(P0.05);25Hz r TMS組對(duì)各突觸參數(shù)的影響無顯著意義。與5Hz r TMS組比較,25Hz r TMS組在r TMS后1天可見突觸曲率顯著增加,在r TMS后7天表現(xiàn)為突觸寬度顯著增加(P0.05),提示(1)在r TMS后1天及7天,突觸超微結(jié)構(gòu)參數(shù)都受到了影響,隨著時(shí)間推移受影響的突觸結(jié)構(gòu)也在不斷變化;與sham組相比,r TMS后1天比7天時(shí)間點(diǎn),受影響的參數(shù)更多,推測(cè)r TMS的近時(shí)效應(yīng)比遠(yuǎn)時(shí)效應(yīng)更顯著;(2)在1天及7天時(shí)間點(diǎn),5Hz r TMS組均比25Hz r TMS組對(duì)突觸參數(shù)的影響更明顯,推測(cè)5Hz r TMS作用可能優(yōu)于25Hz r TMS。2 r TMS增加老齡鼠海馬區(qū)神經(jīng)元前體標(biāo)志蛋白DCX及突觸標(biāo)志蛋白SYN、PSD95表達(dá)Western blot結(jié)果顯示,r TMS后1天:與sham組小鼠相比,神經(jīng)元前體標(biāo)志物Doublecortin(DCX)在5Hz r TMS組表達(dá)增加(*P0.05),而25Hz r TMS組表達(dá)無顯著差異;r TMS后7天,DCX表達(dá)在三組間比較無顯著差異。突觸前標(biāo)志物突觸素(SYN)及突觸后標(biāo)志物PSD95,在r TMS后1天及7天顯示出相同的變化趨勢(shì),即與sham組小鼠相比,兩r TMS組蛋白表達(dá)均明顯升高(P0.05),并且5Hz與25Hz之間比較變化無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示5Hz r TMS后短時(shí)間內(nèi)DCX可能呈一過性增高,而突觸標(biāo)志蛋白在r TMS后短時(shí)及長(zhǎng)時(shí)階段均有增加。第三部分高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激調(diào)節(jié)老齡鼠海馬突觸功能可塑性相關(guān)基因及蛋白水平目的:從突觸功能可塑性方面探討高頻r TMS改善老齡小鼠認(rèn)知功能障礙的可能機(jī)制。方法:第一部分Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,選取三組老齡小鼠,每組12只,進(jìn)行本部分實(shí)驗(yàn)研究,具體磁刺激干預(yù)方案及分組如下:(1)sham組:15月齡昆明小鼠12只,將磁刺激線圈置于小鼠顱頂上方,不接觸顱頂,以磁頭反面進(jìn)行與r TMS組相同的操作。(2)5Hz r TMS組:15月齡昆明小鼠12只,MCF-b65型8字線圈置于小鼠顱頂上方,不接觸顱頂,進(jìn)行每天10串頻率為5Hz的磁刺激,總共1000個(gè)脈沖刺激,刺激強(qiáng)度為20%最大輸出強(qiáng)度;連續(xù)14天。(3)25 Hz r TMS組:15月齡昆明小鼠12只,MCF-b65型8字線圈置于小鼠顱頂上方,不接觸顱頂,進(jìn)行每天10串頻率為25Hz的磁刺激,總共1000個(gè)脈沖刺激,刺激強(qiáng)度為20%最大輸出強(qiáng)度;連續(xù)14天。磁刺激干預(yù)結(jié)束后7天(MWM實(shí)驗(yàn)后)處死小鼠,取海馬組織,以PCR微陣列法(PCR array)高通量檢測(cè)海馬突觸可塑性相關(guān)基因變化模式,分析不同磁刺激方案對(duì)突觸功能可塑性相關(guān)通路的影響,并采用免疫印跡及免疫組化法觀察突觸可塑性相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:1 r TMS對(duì)老齡昆明小鼠突觸可塑性相關(guān)基因的影響根據(jù)功能將微陣列中84個(gè)突觸可塑性相關(guān)基因歸為十類,包括:即刻早期基因(IEGs),晚反應(yīng)基因(Late Response Genes),LTP相關(guān)基因,LTD相關(guān)基因,細(xì)胞粘附(Cell Adhesion)相關(guān)基因、CREB反應(yīng)元件輔助因子(CREB Cofactors)、細(xì)胞外基質(zhì)及蛋白酶解相關(guān)基因(Extracellular MatrixProteolytic Processing,EMPP)、神經(jīng)受體(Neuronal Receptors,NR)、突觸后致密物(Postsynaptic Density,PSD)相關(guān)基因及其他與突觸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因。結(jié)果顯示,差異基因主要集中歸屬于CREB反應(yīng)元件輔助因子、LTP、PSD相關(guān)基因及IEGs等幾個(gè)大類。不同頻率磁刺激可使老齡昆明小鼠突觸可塑性相關(guān)基因表達(dá)模式發(fā)生改變。根據(jù)基因變化情況,我們選擇上調(diào)或下調(diào)超過1.5倍作為差異基因入選標(biāo)準(zhǔn),共發(fā)現(xiàn)有58種基因在三組間兩兩比較時(shí)至少出現(xiàn)一次大于1.5倍的改變。與假刺激組相比,5 Hz r TMS組有12個(gè)基因至少上調(diào)1.5倍,其中4個(gè)上調(diào)大于2倍:Bdnf、Adcy1(AC1)、Dlg4(Psd95)、Camk2g,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,上調(diào)倍數(shù)最高的基因?yàn)锽dnf 4.22倍。僅有一個(gè)有意義的下調(diào)基因Ppp1ca(PP1):下調(diào)2.08倍。與假刺激組相比,25 Hz r TMS組差異基因顯著減少,僅有3個(gè)基因至少下調(diào)2倍:Timp1、Tnf-α、Nt-4/5,最大下調(diào)2.64倍。5 Hz組與25 Hz組比較出現(xiàn)21個(gè)差異基因,均為上調(diào)趨勢(shì),其中10個(gè)變化大于2倍,最大上調(diào)基因?yàn)锽dnf 3.27倍。結(jié)合KEGG(京都基因與基因組百科全書)通路分析發(fā)現(xiàn),5 Hz組與sham組比較,差異基因與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路、c AMP信號(hào)通路中的因子有較多重疊;25 Hz組與sham組比較,差異表達(dá)基因僅有3個(gè),作用無集中在某一通路的傾向;5 Hz組與25 Hz組比較,差異基因與谷氨酸能突觸相關(guān)通路中的多個(gè)因子重疊。2 r TMS對(duì)老齡昆明小鼠突觸可塑性相關(guān)蛋白的影響2.1 r TMS促進(jìn)老齡海馬突觸可塑性相關(guān)蛋白BDNF及p CREB的表達(dá)Western blotting結(jié)果顯示:與sham組比,兩個(gè)刺激組CREB總蛋白水平無明顯變化(P0.05),但在5 Hz r TMS組其磷酸化蛋白p CREB明顯提高(P0.05)。25 Hz r TMS組也有增加的趨勢(shì),但差異無顯著性。BDNF蛋白變化顯現(xiàn)出與磷酸化p CREB一致的模式,即5 Hz r TMS組蛋白表達(dá)水平明顯提高;25 Hz r TMS組增加不明顯。2.2 r TMS促進(jìn)老齡鼠海馬DG區(qū)BDNF及p CREB的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色,彌散分布在海馬區(qū),在海馬各亞區(qū)神經(jīng)元及胞漿均有不同程度著色。5Hz r TMS組可見BDNF及p CREB在老齡腦海馬,特別是DG區(qū),陽(yáng)性細(xì)胞較sham組明顯增加,而總CREB表達(dá)在各組間及海馬各亞區(qū)之間無明顯差異。兩刺激組比較無顯著差異。第四部分高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激調(diào)節(jié)老齡鼠認(rèn)知相關(guān)海馬代謝產(chǎn)物變化目的:從代謝組學(xué)角度觀察r TMS作用后腦組織的代謝差異物質(zhì),探索高頻r TMS改善老齡小鼠認(rèn)知功能障礙的可能代謝標(biāo)記物。方法:第一部分NOR行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,選取三組老齡小鼠,每組6只,進(jìn)行后續(xù)代謝組學(xué)檢測(cè),磁刺激干預(yù)方案及分組同第三部分。應(yīng)用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)分析方法對(duì)小鼠海馬組織代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),應(yīng)用主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares analysis,OPLS-DA)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,進(jìn)一步應(yīng)用兩兩比較的t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法深入分析差異代謝物。將篩選出的差異物質(zhì)與老齡小鼠NOR行為學(xué)成績(jī)進(jìn)行相關(guān)性分析,尋找與認(rèn)知相關(guān)的小分子代謝物。結(jié)果:1 r TMS對(duì)老齡鼠海馬組織代謝產(chǎn)物的PCA分析及OPLS-DA分析r TMS干預(yù)可以使腦組織代謝物輪廓發(fā)生變化,共得出499個(gè)離子峰用來做進(jìn)一步分析。采用SIMCA-P軟件進(jìn)行PCA多元分析,PCA得分圖顯示,三組樣本分布于三個(gè)不同的區(qū)域,但各群之間分離度不顯著。為了得到更精確的結(jié)果,應(yīng)用OPLS-DA分析以最大程度的區(qū)分兩組之間的差異物,結(jié)果顯示兩兩比較時(shí)不同組別均分布到不同的區(qū)域,并且所有樣本均在95%可信區(qū)間范圍內(nèi),三組兩兩比較時(shí)不同組別均分布到不同的區(qū)域,R2Y值分別為:0.983,0.994和0.990,Q2Y值分別為:0.423,0.732和0.678,說明該模型穩(wěn)健并有很好的預(yù)測(cè)性。此外,7倍交叉驗(yàn)證和200次置換檢驗(yàn)顯示兩兩比較時(shí)Q2值均較低,進(jìn)一步證實(shí)模型穩(wěn)健性和預(yù)測(cè)性良好。2 r TMS影響老齡鼠海馬代謝產(chǎn)物的差異分析應(yīng)用SPSS13.0對(duì)這些變量進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析,根據(jù)variable importance in the projection(VIP)1且P0.05作為標(biāo)準(zhǔn),sham v.s.5Hz r TMS有28個(gè)變量被選出來,sham v.s.25Hz r TMS有13個(gè)變量被篩選出來,詳見Table1;5Hz r TMS v.s.25Hz r TMS僅有1個(gè)變量滿足篩選條件,所對(duì)應(yīng)物質(zhì)為膽固醇(Cholesterol,Cho),similarity:722(reliable),VIP=1.9959,P=0.0400,Fold change:上調(diào)0.92倍。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),與sham相比,在5Hz r TMS組僅反油酸(Ela)大幅(2倍)降低,油酸(Ole)、十二烷酸(Lau)、戊酮酸(Ket)、亞油酸(Lin)、酵母甾醇(Zym)、氨基丙二酸(Ama)、葡萄糖內(nèi)酯(Gll)均大幅升高。25Hz r TMS組油酸、十二烷酸、亞油酸、酵母甾醇、葡萄糖內(nèi)酯也大幅升高,大幅下降的只有槐二糖(Sop)。這些有顯著變化的差異物質(zhì)中油酸及十二烷酸均為可靠指認(rèn)物質(zhì),其變化差異均超過20倍;其余物質(zhì)均為推定成份。3差異代謝產(chǎn)物與認(rèn)知功能的相關(guān)性分析將所篩選出的可靠差異代謝物油酸及十二烷酸與第一部分老齡小鼠的NOR實(shí)驗(yàn)DI成績(jī)進(jìn)行相關(guān)性分析,以|Pearson相關(guān)系數(shù)|0.5和P0.05為標(biāo)準(zhǔn),最終發(fā)現(xiàn)油酸(oleic oil)與r TMS干預(yù)老齡腦后的認(rèn)知改變密切相關(guān),而十二烷酸無顯著相關(guān)性。結(jié)論:1老齡昆明小鼠的認(rèn)知功能較青年鼠出現(xiàn)下降,是研究正常老人群腦老化的理想模型;應(yīng)用高頻r TMS可以改善老齡相關(guān)認(rèn)知功能下降。5Hz及25Hz高頻r TMS方案均具有良好的安全性。2高頻r TMS可以改善老齡腦神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)可塑性,突觸結(jié)構(gòu)可塑性對(duì)r TMS的響應(yīng)模式可能隨時(shí)間變化,近時(shí)效應(yīng)優(yōu)于遠(yuǎn)時(shí)效應(yīng);在突觸前及突觸后均有作用;高頻r TMS可以改善老齡腦海馬突觸功能可塑性,5Hz高頻r TMS可能通過激活c AMP/PKA/CREB及BDNF-Trk B/CREB相關(guān)環(huán)路,發(fā)揮正性調(diào)控作用,BDNF及活化的CREB是其中的關(guān)鍵因子。海馬DG區(qū)可能是r TMS發(fā)揮作用的主要部位。3高頻r TMS可以影響老齡鼠海馬組織代謝譜,在這些差異代謝產(chǎn)物中,油酸及十二烷酸含量增加,其中油酸可能是一個(gè)較為特殊的與認(rèn)知功能相關(guān)的潛在代謝標(biāo)志物。4總體而言,5Hz頻率的刺激在改善老齡腦認(rèn)知功能及相關(guān)機(jī)制方面的作用比25Hz磁刺激明顯。
【關(guān)鍵詞】：高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激 腦老化 認(rèn)知障礙 突觸可塑性 代謝組
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.1
【目錄】：

• 中文摘要5-14
• 英文摘要14-24
• 英文縮寫24-26
• 引言26-28
• 第一部分 高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激改善小鼠老齡相關(guān)認(rèn)知功能障礙28-47
• 前言28-30
• 材料與方法30-33
• 結(jié)果33-35
• 附圖35-39
• 討論39-42
• 小結(jié)42-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 第二部分 高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激改善老齡鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)可塑性47-70
• 前言47-49
• 材料與方法49-55
• 結(jié)果55-57
• 附圖57-60
• 附表60-61
• 討論61-65
• 小結(jié)65-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 第三部分 高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激調(diào)節(jié)老齡鼠海馬突觸功能可塑性相關(guān)基因及蛋白水平70-99
• 前言70-72
• 材料與方法72-77
• 結(jié)果77-79
• 附圖79-87
• 附表87-91
• 討論91-95
• 小結(jié)95-96
• 參考文獻(xiàn)96-99
• 第四部分 高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激調(diào)節(jié)老齡鼠海馬認(rèn)知相關(guān)代謝產(chǎn)物變化99-120
• 前言99-100
• 材料與方法100-104
• 結(jié)果104-106
• 附圖106-111
• 附表111-113
• 討論113-116
• 小結(jié)116-117
• 參考文獻(xiàn)117-120
• 結(jié)論120-121
• 綜述 經(jīng)顱磁刺激影響認(rèn)知功能的神經(jīng)機(jī)制121-139
• 參考文獻(xiàn)131-139
• 致謝139-140
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷140

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1019432