本文關(guān)鍵詞：硒蛋白SelK對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿游離鈣水平及遷移能力的影響

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【摘要】：小膠質(zhì)細(xì)胞是腦中的”巨噬細(xì)胞”,在阿爾茨海默病(AD)發(fā)生中具重要作用。硒蛋白SelK是小鼠腦中含量較高的硒蛋白之一,已有研究表明,SelK在活化的巨噬細(xì)胞中保持完整而在靜息態(tài)巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞中被剪切,完整的SelK能促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子釋放,從而提高吞噬、遷移能力。SelK是否在處于活化態(tài)和靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞中也保持兩種狀態(tài),其存在狀態(tài)和表達(dá)量是否影響到細(xì)胞中游離鈣離子水平、遷移能力,以及是否與阿爾茨海默病(AD)的發(fā)生有關(guān),是亟需解決的重要科學(xué)問題。為此本論文擬通過對(duì)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行SelK基因敲減和過表達(dá),闡明SelK與小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿中游離鈣離子水平間和遷移能力之間的關(guān)系。部分研究資料顯示血液來源單核細(xì)胞清除Aβ蛋白更為有效,為此本論文在研究SelK對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞作用的同時(shí),也對(duì)單核細(xì)胞的作用進(jìn)行了研究。為達(dá)到對(duì)小鼠中上述兩種細(xì)胞中硒蛋白mSelK的有效敲減,我們首先進(jìn)行了小鼠硒蛋白mSelK表達(dá)敲減慢病毒載體的構(gòu)建工作。將pLKO.1-TRC初始載體中Agel和EcoRI酶切位點(diǎn)之間1.9kb大小的插入片段切除,插入SelK的ShRNA退火片段構(gòu)建pLKO.1-mSelK-ShRNA載體。將pLKO.1-mSelK-ShRNA載體與包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G共同轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,從而構(gòu)建mSelK表達(dá)敲減慢病毒重組載體pLKO.1-mSelK-ShRNA。用RT-PCR和qPCR方法考察了mSelK表達(dá)敲減慢病毒重組載體對(duì)上述兩種細(xì)胞中mSelK的敲減能力。結(jié)果顯示,在小膠質(zhì)細(xì)胞BV2和單核細(xì)胞RAW264.7中mSelK的mRNA含量顯著降低,通過2-ΔΔCt粗略計(jì)算出其mSelK的表達(dá)水平分別僅為原來的0.09倍和0.21倍。從中可以看出,慢病毒基因敲出nSelK的效果非常明顯。并且mSelK表達(dá)敲減慢病毒重組載體的侵染對(duì)細(xì)胞活力和非刺激條件下細(xì)胞的活化程度沒有顯著影響。用mSelK表達(dá)敲減慢病毒重組載體侵染小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2和單核細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞,考察硒蛋白SelK的敲減對(duì)靜息狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿內(nèi)游離鈣水平及細(xì)胞遷移能力的影響。其中對(duì)細(xì)胞胞漿中游離鈣的釋放的影響通過鈣離子探針Fluo-3 AM染色及流式細(xì)胞儀測(cè)定,對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響通過1transwell小室法測(cè)定。結(jié)果顯示,與未侵染病毒的空白對(duì)照組和侵染對(duì)照載體的陰性對(duì)照相比,nSelK表達(dá)敲減慢病毒載體的侵染細(xì)胞胞漿中的游離鈣水平顯著下降,細(xì)胞遷移能力顯著降低。接下來我們?cè)谙俨《緋HBAd-RFP表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了小鼠硒蛋白mSelK過表達(dá)腺病毒重組載體pHBAd-RFP-mSelK,以便于接下來所進(jìn)行的研究。通過western blot證明nSelK過表達(dá)腺病毒重組載體在上述兩種細(xì)胞中能夠進(jìn)行高效表達(dá)。并且mSelK過表達(dá)腺病毒重組載體的侵染對(duì)細(xì)胞活力和非刺激條件下細(xì)胞的活化程度沒有顯著影響。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)nSelK過表達(dá)對(duì)小鼠靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞中游離鈣離子水平的影響,通過Transwell小室法檢測(cè)mSelK過表達(dá)對(duì)上述細(xì)胞遷移能力的影響,從而證明硒蛋白nSelK在小膠質(zhì)細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞中的作用。結(jié)果顯示,與空白組和腺病毒空載體組相比,當(dāng)硒蛋白過表達(dá)時(shí),細(xì)胞胞漿中游離鈣水平顯著升高,上述細(xì)胞的遷移能力顯著上升。用小鼠硒蛋白nSelK腺病毒過表達(dá)載體侵染小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞以便提高mSel K在細(xì)胞中的基因數(shù),然后通過vestern blot檢測(cè)小鼠硒蛋白Ad-mSelK在靜息狀態(tài)和激活狀態(tài)時(shí)的剪切狀態(tài)及表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞由靜息態(tài)變?yōu)榧せ顟B(tài)時(shí),mSelK逐漸由以剪切狀態(tài)為主變?yōu)橐匀L狀態(tài)為主,硒蛋白的表達(dá)量大幅增加。表明硒蛋白mSelK主要在細(xì)胞的活化過程中發(fā)揮作用。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出如下結(jié)論：硒蛋白SelK能夠通過控制細(xì)胞漿內(nèi)游離鈣離子的水平,從而控制小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞的遷移能力。當(dāng)硒蛋白mSelK表達(dá)量顯著下降時(shí)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿中的游離鈣水平顯著下降,細(xì)胞的遷移能力也隨之顯著下降；當(dāng)硒蛋白nSelK表達(dá)量顯著上升時(shí)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿中的游離鈣水平也顯著上升,細(xì)胞的遷移能力也隨之顯著提高。并且硒蛋白SelK在靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞中處于剪切狀態(tài),而在活化的細(xì)胞中,當(dāng)發(fā)揮吞噬和遷移能力大量需要鈣離子時(shí),保持完整,并且表達(dá)量顯著提高,這對(duì)于阿爾茲海默癥的防治是極為有力的。
【關(guān)鍵詞】：硒蛋白 SelK 鈣離子 遷移 阿爾茨海默病
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-16
• 引言16-22
• 0.1 硒蛋白16-17
• 0.2 阿爾茨海默病及其發(fā)病機(jī)理、研究意義17
• 0.3 小膠質(zhì)細(xì)胞、骨髓/血液來源單核細(xì)胞與阿爾茨海默病之間關(guān)系17-20
• 0.4 硒蛋白與阿爾茨海默病之間關(guān)系的研究進(jìn)展20
• 0.5 研究目的和意義20-22
• 第1章 小鼠硒蛋白mSelK表達(dá)敲減慢病毒載體的構(gòu)建22-32
• 1.1 實(shí)驗(yàn)方案22
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法22-30
• 1.2.1 分子生物學(xué)常用酶22
• 1.2.2 菌種、細(xì)胞與質(zhì)粒22-23
• 1.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器23
• 1.2.4 常用試劑23-24
• 1.2.5 pLKO.1-mSelK-ShRNA載體的構(gòu)建24-28
• 1.2.6 慢病毒包裝28-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析30-31
• 1.3.1 重組慢病毒載體的酶切驗(yàn)證30-31
• 1.3.2 重組慢病毒載體的293T細(xì)胞包裝結(jié)果31
• 1.4 小結(jié)31-32
• 第2章 慢病毒載體pLKO.1-mSelK-ShRNA對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞的游離鈣水平及遷移能力的影響32-51
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料32-34
• 2.1.1 細(xì)胞32
• 2.1.2 培養(yǎng)基和試劑32-33
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器33-34
• 2.1.4 常用生化試劑34
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法34-43
• 2.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)34-35
• 2.2.2 慢病毒載體mSelK-ShRNA侵染侵染小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞35
• 2.2.3 RT-PCR法考察細(xì)胞內(nèi)mSelK基因敲減后mRNA表達(dá)的變化35-38
• 2.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR法考察細(xì)胞內(nèi)mSelK基因沉默后mRNA表達(dá)的變化38-40
• 2.2.5 MTT法檢測(cè)慢病毒侵染后的細(xì)胞活力40-41
• 2.2.6 慢病毒侵染后細(xì)胞活化程度的NO測(cè)定41-42
• 2.2.7 慢病毒載體侵染對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿中游離鈣離子濃度的影響42
• 2.2.8 慢病毒載體侵染對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞遷移能力的影響42-43
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-50
• 2.3.1 mSelK-ShRNA慢病毒重組載體侵染BV2及RAW264.7的最佳MOI43-44
• 2.3.2 RNA完整性鑒定44
• 2.3.3 RT-PCR法考察細(xì)胞內(nèi)mSelK基因沉默后mRNA表達(dá)的變化44-45
• 2.3.4 實(shí)時(shí)定量PCR法考察細(xì)胞內(nèi)mSelK基因沉默后mRNA表達(dá)的變化45-46
• 2.3.5 mSelK-ShRNA慢病毒重組載體侵染對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響46-47
• 2.3.6 mSelK-ShRNA慢病毒重組載體侵染對(duì)非刺激條件下小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響47-48
• 2.3.7 mSelK-ShRNA慢病毒重組載體侵染對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿游離Ca~(2+)濃度的影響48-49
• 2.3.8 mSelK-ShRNA慢病毒載體侵染BV2細(xì)胞遷移能力的影響49
• 2.3.9 mSelK-ShRNA慢病毒載體侵染RAW264.7細(xì)胞遷移能力的影響49-50
• 2.4 分析與討論50
• 2.5 小結(jié)50-51
• 第3章 mSelK過表達(dá)腺病毒重組載體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞中游離鈣水平及遷移能力的影響51-75
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料51-53
• 3.1.1 細(xì)胞51
• 3.1.2 培養(yǎng)基和試劑51-52
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器52-53
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法53-65
• 3.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)53
• 3.2.2 mSelK過表達(dá)腺病毒重組載體pHBAd-mSelK的擴(kuò)增53-54
• 3.2.3 腺病毒TCID50病毒滴度測(cè)定54-55
• 3.2.4 用mSelK過表達(dá)腺病毒重組載體侵染小膠質(zhì)細(xì)胞55
• 3.2.5 MTT法檢測(cè)腺病毒侵染后的細(xì)胞活力55-56
• 3.2.6 Gress法檢測(cè)非刺激條件下腺病毒侵染對(duì)細(xì)胞活化狀態(tài)的影響56
• 3.2.7 mSelK過表達(dá)腺病毒重組載體侵染對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿中游離鈣離子濃度的影響56
• 3.2.8 mSelK過表達(dá)腺病毒重組載體侵染對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞遷移能力的影響56-57
• 3.2.9 Western Blot法考察細(xì)胞內(nèi)mSelK過表達(dá)腺病毒重組載體侵染對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞mSelK蛋白表達(dá)量的影響57-64
• 3.2.10 Western Blot考察脂多糖LPS刺激對(duì)小鼠硒蛋白mSelK的剪切狀態(tài)及表達(dá)量的影響64-65
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果65-73
• 3.3.1 pHBAd-MCMV-RFP-SelK重組載體測(cè)序結(jié)果65-66
• 3.3.2 mSelK過表達(dá)腺病毒重組載體pHBAd-mSelK的擴(kuò)增66-67
• 3.3.3 擴(kuò)增后腺病毒TCID50病毒滴度測(cè)定67-68
• 3.3.4 腺病毒Ad-mSelK過表達(dá)載體侵染小膠質(zhì)細(xì)胞的MOI68-69
• 3.3.5 MTT法檢測(cè)腺病毒侵染后的細(xì)胞活力69-70
• 3.3.6 腺病毒侵染對(duì)非刺激條件下細(xì)胞活化狀態(tài)的影響70
• 3.3.7 腺病毒重組載體侵染對(duì)BV2細(xì)胞胞漿中游離鈣離子濃度的影響70-71
• 3.3.8 腺病毒重組載體侵染對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響71-72
• 3.3.9 BCA蛋白定量分析結(jié)果72-73
• 3.3.10 腺病毒重組載體Ad-mSelK侵染小膠質(zhì)細(xì)胞后,細(xì)胞中硒蛋白mSelK表達(dá)量升高的驗(yàn)證73
• 3.4 分析與討論73-74
• 3.5 小結(jié)74-75
• 結(jié)論與展望75-76
• 致謝76-77
• 參考文獻(xiàn)77-81
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文及參加科研情況81

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 肖亞;趙斌;;小膠質(zhì)細(xì)胞在阿爾茨海默病發(fā)病中的作用研究進(jìn)展[J];神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生;2010年01期

2 宋陽;薛一雪;朱麗娜;劉云會(huì);;移植小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)阿爾茨海默病大鼠腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白的吞噬作用[J];中國老年學(xué)雜志;2008年03期

3 林玨龍;陳耀文;謝仰民;李玫;樸仲賢;楊海偉;;小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子變化介導(dǎo)的吞噬作用(英文)[J];激光生物學(xué)報(bào);2006年01期

4 李谷才,尹端l，

本文編號(hào)：1006510