本文關(guān)鍵詞：人FHL1各LIM結(jié)構(gòu)域融合蛋白的原核表達(dá)、純化及活性檢測(cè)

  更多相關(guān)文章： 人FHL-LIM/、-LIM、-LIM、-LIM和-LIM基因 原核表達(dá) 純化 ERα

【摘要】：目的構(gòu)建人FHL1各LIM結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)載體,獲得純化的GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4融合蛋白,并對(duì)其活性進(jìn)行檢測(cè)。方法用PCR法從FHL1真核表達(dá)載體中擴(kuò)增FHL1的LIM1/2、LIM1、LIM2、LIM3和LIM4基因編碼序列,將其正確插入pGEX-KG載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate表達(dá)后,用GST-Sepharose 4B珠子純化融合蛋白,并用Western blot法檢測(cè)融合蛋白表達(dá),通過GST pull-down技術(shù)檢測(cè)純化蛋白與已知結(jié)合蛋白雌激素受體α(ERα)的相互作用。結(jié)果構(gòu)建得到FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4基因的原核表達(dá)載體,雙酶切鑒定得到與預(yù)期片段大小相符的外源基因插入片段,經(jīng)測(cè)序與目的序列完全一致;在Rossate菌中誘導(dǎo)表達(dá)出與預(yù)期大小相符的目的蛋白,經(jīng)Western blot法檢測(cè),融合蛋白成功表達(dá);純化得到GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4五個(gè)融合蛋白,GST pull-down證明FHL1全長以及FHL1-LIM1/2、-LIM2蛋白可以和ERα相互作用。結(jié)論成功克隆FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4基因,并獲得了活性良好的GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4蛋白,為研究FHL1在乳腺癌中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【作者單位】： 解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科;軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所;解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科;
【關(guān)鍵詞】： 人FHL-LIM/、-LIM、-LIM、-LIM和-LIM基因 原核表達(dá) 純化 ERα
【基金】：國家自然科學(xué)基金(31100604,30872939,81101065)
【分類號(hào)】：R392.12
【正文快照】： FHL(four and a half LIM domain)家族屬于LIM超家族,目前發(fā)現(xiàn)的FHL家族成員包括FHL1、FHL2、FHL3、FHL4和FHL5(ACT),它們均由4.5個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域組成,即含有氨基端半個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域(LIM1/2)和其后的4個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域(即LIM1、LIM2、LIM3和LIM4)。LIM(Lin-Isl-Mec)結(jié)構(gòu)域含大約50個(gè)氨基

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