本文關鍵詞：人FHL1各LIM結(jié)構域融合蛋白的原核表達、純化及活性檢測

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【摘要】：目的構建人FHL1各LIM結(jié)構域的原核表達載體,獲得純化的GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4融合蛋白,并對其活性進行檢測。方法用PCR法從FHL1真核表達載體中擴增FHL1的LIM1/2、LIM1、LIM2、LIM3和LIM4基因編碼序列,將其正確插入pGEX-KG載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate表達后,用GST-Sepharose 4B珠子純化融合蛋白,并用Western blot法檢測融合蛋白表達,通過GST pull-down技術檢測純化蛋白與已知結(jié)合蛋白雌激素受體α(ERα)的相互作用。結(jié)果構建得到FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4基因的原核表達載體,雙酶切鑒定得到與預期片段大小相符的外源基因插入片段,經(jīng)測序與目的序列完全一致;在Rossate菌中誘導表達出與預期大小相符的目的蛋白,經(jīng)Western blot法檢測,融合蛋白成功表達;純化得到GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4五個融合蛋白,GST pull-down證明FHL1全長以及FHL1-LIM1/2、-LIM2蛋白可以和ERα相互作用。結(jié)論成功克隆FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4基因,并獲得了活性良好的GST-FHL1-LIM1/2、-LIM1、-LIM2、-LIM3和-LIM4蛋白,為研究FHL1在乳腺癌中的作用奠定了實驗基礎。
【作者單位】： 解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科;軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所;解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科;
【關鍵詞】： 人FHL-LIM/、-LIM、-LIM、-LIM和-LIM基因 原核表達 純化 ERα
【基金】：國家自然科學基金(31100604,30872939,81101065)
【分類號】：R392.12
【正文快照】： FHL(four and a half LIM domain)家族屬于LIM超家族,目前發(fā)現(xiàn)的FHL家族成員包括FHL1、FHL2、FHL3、FHL4和FHL5(ACT),它們均由4.5個LIM結(jié)構域組成,即含有氨基端半個LIM結(jié)構域(LIM1/2)和其后的4個LIM結(jié)構域(即LIM1、LIM2、LIM3和LIM4)。LIM(Lin-Isl-Mec)結(jié)構域含大約50個氨基

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本文編號：980351