發(fā)布時間：2017-10-03 01:01

  本文關(guān)鍵詞：狂犬病病毒基質(zhì)蛋白的原核表達及其間接ELISA方法的建立

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【摘要】：目的以原核表達的狂犬病病毒M蛋白作為檢測抗原,建立間接ELISA方法用來檢測狂犬病病毒抗體。方法為表達狂犬病病毒(RV)基質(zhì)蛋白(M),采用RT-PCR方法從狂犬病病毒Flury-LEP株中擴增RV基質(zhì)蛋白基因,雙酶切后定向克隆至原核表達載體pET-32a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-M。將重組質(zhì)粒pET-M轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coli Rosetta中進行表達。SDS-PAGE和Western blot分析確定蛋白表達量和特異性。用純化的重組M蛋白作為包被抗原建立檢測犬RV抗體的間接ELISA方法,通過優(yōu)化反應條件,確定抗原最佳包被量、血清的最佳稀釋度、Protein A-HRP的最佳稀釋度。結(jié)果經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定,重組質(zhì)粒pET-M構(gòu)建成功,將重組質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化后誘導表達,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析得到高效表達的M蛋白,重組蛋白可被RV陽性血清特異性識別,表明基質(zhì)蛋白具有良好的反應原性。用表達的狂犬病病毒M蛋白建立了檢測RV抗體的間接ELISA方法,用該間接ELISA方法與以狂犬病病毒作為診斷抗原的商品化ELISA試劑盒分別對93份臨床血清樣品進行檢測,結(jié)果兩者的符合率為89.2%。結(jié)論用原核表達的重組M蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法可用做檢測犬RV抗體水平的參考。
【作者單位】： 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學國家重點實驗室農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)北京科學觀測實驗站;
【關(guān)鍵詞】： 狂犬病病毒 基質(zhì)蛋白 原核表達 蛋白純化 酶聯(lián)免疫吸附試驗
【基金】：國家自然科學基金(No.31172342) 國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”計劃(No.2008AA10Z411) 北京市科委基金項目(No.Z07010501780701) 國家農(nóng)業(yè)行業(yè)公益項目(No.200903037) FAO/IAEA項目(No.14133,No.14515,No.17453)聯(lián)合資助~~
【分類號】：S855.3;R373
【正文快照】： 狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)引起的人獸共患病,可感染幾乎所有的溫血動物。近年來,我國狂犬病疫情一直呈上升趨勢,病死數(shù)據(jù)居我國37種法定報告?zhèn)魅静≈?據(jù)最新衛(wèi)生部公布的數(shù)據(jù),中國年均2 400人以上的狂犬病死亡人數(shù),僅次于印度,位居全球第二,造成這種形勢的主

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本文編號：962228