本文關(guān)鍵詞：臍帶基質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定及其向生殖細(xì)胞分化的研究

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【摘要】：研究背景與目的傳統(tǒng)理論均認(rèn)為人卵母細(xì)胞是不可再生細(xì)胞,免疫、環(huán)境、遺傳等多種因素及婦科腫瘤的疾病進(jìn)展、治療過(guò)程均可損害卵母細(xì)胞、導(dǎo)致卵巢功能明顯降低,甚至衰竭,喪失生育功能,在神經(jīng)、骨骼、內(nèi)分泌等多方面影響女性的身心健康~[1-3]。這一類患者即使通過(guò)輔助生殖技術(shù)也無(wú)法獲得有功能的卵子。因此,獲得再生卵母細(xì)胞,是真正有助于解決這類患者無(wú)法生育及恢復(fù)其生殖-內(nèi)分泌功能的重要途徑~[4]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),干細(xì)胞具備發(fā)育全能性,在一定條件下于體內(nèi)或體外均可誘導(dǎo)分化為功能細(xì)胞~[5-7]。有關(guān)胚胎干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn):胚胎原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植可產(chǎn)生有功能的卵母細(xì)胞和精子,并成功生育子代~[8]。但胚胎干細(xì)胞無(wú)法做到自體移植,取材不便、有致瘤性等諸多問(wèn)題使其研究受到限制~[9]。因此,人們將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向成體干細(xì)胞。其中臍帶基質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs),來(lái)源于新生兒臍帶,不需要任何侵入性的過(guò)程就可以在廢棄的臍帶當(dāng)中獲取它,不存在倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)勢(shì),均使其成為再生卵母細(xì)胞的重要種子來(lái)源~[10]。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn),該細(xì)胞具有分化為卵母樣細(xì)胞的潛能,可表達(dá)原始生殖細(xì)胞標(biāo)記物,且能在卵巢局部存活并生長(zhǎng)。但均尚未獲得功能性配子~[11]。究其原因,與體外使用卵巢卵泡液等誘導(dǎo)方式尚無(wú)法完全模擬體內(nèi)微環(huán)境有關(guān)。研究顯示性腺來(lái)源的體細(xì)胞更有助于生殖細(xì)胞分化~[12],且同步化的卵巢體細(xì)胞才能促進(jìn)原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell,PGCs)進(jìn)一步減數(shù)分裂~[13]。由此我們認(rèn)為減數(shù)分裂前期的胚胎卵巢與干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),有望更好地模擬體內(nèi)卵巢卵子發(fā)生的微環(huán)境,同時(shí)充分利用卵巢細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行環(huán)境誘導(dǎo),可能更有助于觀察卵巢微環(huán)境在卵子發(fā)生中的作用,探索成體干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的可能機(jī)制。因此我們擬對(duì)UCMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定,再與原始生殖細(xì)胞共培養(yǎng),誘導(dǎo)UCMSCs向卵母細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行分化,探索其體外誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的可能機(jī)制,為完全卵母細(xì)胞再生的研究提供思路。1實(shí)驗(yàn)方法1.1 UCMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定采用機(jī)械分離方法提取新生兒臍帶膠質(zhì)、進(jìn)行剪碎后行組織塊直接貼壁培養(yǎng)UCMSCs,運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)UCMSCs的免疫表型,進(jìn)行干細(xì)胞鑒定,將P3代UCMSCs作為種子細(xì)胞。1.2 PGCs的分離培養(yǎng)及鑒定采用機(jī)械分離12.5dpc(days posteoltum,發(fā)現(xiàn)陰栓的當(dāng)天記為0.5dpc)的Balb/c小鼠的胎鼠生殖嵴,剪碎后行組織塊直接貼壁培養(yǎng)PGCs,運(yùn)用AP染色初步鑒定細(xì)胞、運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)P3代PGCs的免疫表型,進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞鑒定。1.3 PGCs的生物學(xué)特性研究取P3代PGCs,細(xì)胞免疫熒光染色,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等技術(shù)進(jìn)行PGCs的生物學(xué)特性研究。1.4誘導(dǎo)UCMSCs向原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(Primordial germ cell-like cells,PGCLCs)分化及鑒定取P3代UCMSCs,實(shí)驗(yàn)組使用PGCLCs誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng),對(duì)照組繼續(xù)使用UCMSCs培養(yǎng)液,采取置于37℃,5%CO_2及飽和濕度下培養(yǎng),隔日換液,并觀察培養(yǎng)液有無(wú)渾濁。及倒置顯微鏡下對(duì)照兩組細(xì)胞形態(tài)變化。運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)分化后UCMSCs的免疫表型鑒定。1.5共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化UCMSCs取PGCLCs+P0代PGCs為實(shí)驗(yàn)組1,P4代UCMSCs+P0代PGCs為實(shí)驗(yàn)組2,P4代UCMSCs+P4代UCMSCs為對(duì)照組,均利用0.4μm孔徑的Transwell小室共培養(yǎng),置于37℃,5%CO_2及飽和濕度下培養(yǎng),隔日換液,并觀察培養(yǎng)液有無(wú)渾濁。1.6 Western blot檢測(cè)UCMSCs向卵母細(xì)胞分化情況取共培養(yǎng)14d后的UCMSCs進(jìn)行Western blot檢測(cè)SCP3表達(dá)情況,評(píng)估其向卵母細(xì)胞的分化情況。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以(?)表示,組間比較采用單因素x~2檢驗(yàn),P0.05為差異。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 UCMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定倒置顯微鏡下觀察組織塊貼壁培養(yǎng)3-5天后開始有少量長(zhǎng)梭形細(xì)胞爬出,培養(yǎng)7d后細(xì)胞融合達(dá)90%,呈漩渦狀或者平行排列貼壁生長(zhǎng),雜細(xì)胞較少,傳代后細(xì)胞較均一,形態(tài)規(guī)則,呈長(zhǎng)梭形,增殖快,常于傳代后2d再次接近融合狀態(tài)。流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)UCMSCs表達(dá)中胚層來(lái)源分子CD73及分子CD29,陽(yáng)性率分別為62.9%、95.5%,表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特征分子CD31,陽(yáng)性率為0.221%,表達(dá)造血干細(xì)胞系特征分子CD45,陽(yáng)性率為0.186%,表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-1,陽(yáng)性率為0.946%,符合UCMSCs的特征。2.2 PGCs的分離培養(yǎng)及鑒定倒置顯微鏡下觀察生殖嵴組織塊3-5天開始爬出貼壁細(xì)胞,5-7天細(xì)胞能生長(zhǎng)至70%~80%融合,細(xì)胞輪廓清楚,排列緊密,大部分細(xì)胞形態(tài)為核質(zhì)比較大的圓形或者橢圓形細(xì)胞。至80%左右融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代,傳代后細(xì)胞增殖迅速,常于傳代后3天再次接近融合狀態(tài)。AP染色細(xì)胞持續(xù)陽(yáng)性,表明為含有堿性磷酸酶活性陽(yáng)性的胚胎原始生殖細(xì)胞。流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)PGCs表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-1,陽(yáng)性率為92.5%,表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-4,陽(yáng)性率為0.71%,符合小鼠PGCs的特征。2.3 PGCs的生物學(xué)特性研究通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色及RT-PCR檢測(cè)可發(fā)現(xiàn),Oct4、Stra8、Vasa、Scp3、Zp3均為陽(yáng)性表達(dá),表明我們所培養(yǎng)的PGCs是一種來(lái)自小鼠胚胎早期的胚胎生殖細(xì)胞,處于未分化狀態(tài),而且在體外培養(yǎng)過(guò)程中可進(jìn)入減數(shù)分裂I期。2.4誘導(dǎo)UCMSCs向PGCLCs分化及鑒定倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組:經(jīng)過(guò)向PGCLCs誘導(dǎo)7d-9d后,開始出現(xiàn)部分核質(zhì)比大的圓形或橢圓形細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞仍然保持長(zhǎng)梭形形態(tài)。貼壁培養(yǎng)14d后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-1,陽(yáng)性率為73.83%,且表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-3,陽(yáng)性率為66.66%,對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-1及SSEA-3,陽(yáng)性率分別為0.69%、0.45%,證明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞已部分向PGCLCs分化。2.5 Western blot檢測(cè)UCMSCs向卵母細(xì)胞分化情況結(jié)果顯示,共培養(yǎng)14d后,實(shí)驗(yàn)組1的SCP3蛋白表達(dá)水平為0.566622±0.008407,實(shí)驗(yàn)組2的SCP3蛋白表達(dá)水平為0.271562±0.041784,對(duì)照組的SCP3蛋白表達(dá)水平為0.130108±0.022316,三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中任意兩組分別對(duì)比也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3結(jié)論1.分離培養(yǎng)了純度較高的UCMSCs;2.分離培養(yǎng)了純度較高的PGCs;3.PGCs于體外可進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng),體外培養(yǎng)過(guò)程中可進(jìn)入減數(shù)分裂I期;4.UCMSCs于體外可誘導(dǎo)分化為PGCLCs;5.共培養(yǎng)可體外誘導(dǎo)UCMSCs向卵母細(xì)胞方向進(jìn)行分化。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶基質(zhì)干細(xì)胞 小鼠原始生殖細(xì)胞 細(xì)胞共培養(yǎng) 分化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R321
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 臍帶基質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定14-20
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法14-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果16-18
• 2.3 討論18-19
• 2.4 小結(jié)19-20
• 第三章 原始生殖細(xì)胞的分離及其生物學(xué)特性研究20-31
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法20-26
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-29
• 3.3 討論29-30
• 3.4 小結(jié)30-31
• 第四章 臍帶基質(zhì)干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的研究31-43
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法31-38
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-41
• 4.3 討論41-42
• 4.4 小結(jié)42-43
• 全文總結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 文獻(xiàn)綜述 干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的研究進(jìn)展50-58
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 碩士期間發(fā)表文章58-59
• 致謝59

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本文編號(hào)：961333