本文關(guān)鍵詞：臍帶基質(zhì)干細胞的分離、鑒定及其向生殖細胞分化的研究

  更多相關(guān)文章： 人臍帶基質(zhì)干細胞 小鼠原始生殖細胞 細胞共培養(yǎng) 分化

【摘要】：研究背景與目的傳統(tǒng)理論均認為人卵母細胞是不可再生細胞,免疫、環(huán)境、遺傳等多種因素及婦科腫瘤的疾病進展、治療過程均可損害卵母細胞、導(dǎo)致卵巢功能明顯降低,甚至衰竭,喪失生育功能,在神經(jīng)、骨骼、內(nèi)分泌等多方面影響女性的身心健康~[1-3]。這一類患者即使通過輔助生殖技術(shù)也無法獲得有功能的卵子。因此,獲得再生卵母細胞,是真正有助于解決這類患者無法生育及恢復(fù)其生殖-內(nèi)分泌功能的重要途徑~[4]。近年來,國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),干細胞具備發(fā)育全能性,在一定條件下于體內(nèi)或體外均可誘導(dǎo)分化為功能細胞~[5-7]。有關(guān)胚胎干細胞的研究發(fā)現(xiàn):胚胎原始生殖細胞經(jīng)體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植可產(chǎn)生有功能的卵母細胞和精子,并成功生育子代~[8]。但胚胎干細胞無法做到自體移植,取材不便、有致瘤性等諸多問題使其研究受到限制~[9]。因此,人們將研究重點轉(zhuǎn)向成體干細胞。其中臍帶基質(zhì)干細胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs),來源于新生兒臍帶,不需要任何侵入性的過程就可以在廢棄的臍帶當中獲取它,不存在倫理學(xué)爭議等優(yōu)勢,均使其成為再生卵母細胞的重要種子來源~[10]。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn),該細胞具有分化為卵母樣細胞的潛能,可表達原始生殖細胞標記物,且能在卵巢局部存活并生長。但均尚未獲得功能性配子~[11]。究其原因,與體外使用卵巢卵泡液等誘導(dǎo)方式尚無法完全模擬體內(nèi)微環(huán)境有關(guān)。研究顯示性腺來源的體細胞更有助于生殖細胞分化~[12],且同步化的卵巢體細胞才能促進原始生殖細胞(Primordial germ cell,PGCs)進一步減數(shù)分裂~[13]。由此我們認為減數(shù)分裂前期的胚胎卵巢與干細胞進行共培養(yǎng),有望更好地模擬體內(nèi)卵巢卵子發(fā)生的微環(huán)境,同時充分利用卵巢細胞分泌細胞因子等微環(huán)境對干細胞進行環(huán)境誘導(dǎo),可能更有助于觀察卵巢微環(huán)境在卵子發(fā)生中的作用,探索成體干細胞向生殖細胞分化的可能機制。因此我們擬對UCMSCs進行分離培養(yǎng)及鑒定,再與原始生殖細胞共培養(yǎng),誘導(dǎo)UCMSCs向卵母細胞樣細胞進行分化,探索其體外誘導(dǎo)生殖細胞的可能機制,為完全卵母細胞再生的研究提供思路。1實驗方法1.1 UCMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定采用機械分離方法提取新生兒臍帶膠質(zhì)、進行剪碎后行組織塊直接貼壁培養(yǎng)UCMSCs,運用流式細胞學(xué)技術(shù)檢測UCMSCs的免疫表型,進行干細胞鑒定,將P3代UCMSCs作為種子細胞。1.2 PGCs的分離培養(yǎng)及鑒定采用機械分離12.5dpc(days posteoltum,發(fā)現(xiàn)陰栓的當天記為0.5dpc)的Balb/c小鼠的胎鼠生殖嵴,剪碎后行組織塊直接貼壁培養(yǎng)PGCs,運用AP染色初步鑒定細胞、運用流式細胞學(xué)技術(shù)檢測P3代PGCs的免疫表型,進一步進行細胞鑒定。1.3 PGCs的生物學(xué)特性研究取P3代PGCs,細胞免疫熒光染色,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等技術(shù)進行PGCs的生物學(xué)特性研究。1.4誘導(dǎo)UCMSCs向原始生殖細胞樣細胞(Primordial germ cell-like cells,PGCLCs)分化及鑒定取P3代UCMSCs,實驗組使用PGCLCs誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng),對照組繼續(xù)使用UCMSCs培養(yǎng)液,采取置于37℃,5%CO_2及飽和濕度下培養(yǎng),隔日換液,并觀察培養(yǎng)液有無渾濁。及倒置顯微鏡下對照兩組細胞形態(tài)變化。運用流式細胞學(xué)技術(shù)檢測誘導(dǎo)分化后UCMSCs的免疫表型鑒定。1.5共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化UCMSCs取PGCLCs+P0代PGCs為實驗組1,P4代UCMSCs+P0代PGCs為實驗組2,P4代UCMSCs+P4代UCMSCs為對照組,均利用0.4μm孔徑的Transwell小室共培養(yǎng),置于37℃,5%CO_2及飽和濕度下培養(yǎng),隔日換液,并觀察培養(yǎng)液有無渾濁。1.6 Western blot檢測UCMSCs向卵母細胞分化情況取共培養(yǎng)14d后的UCMSCs進行Western blot檢測SCP3表達情況,評估其向卵母細胞的分化情況。1.7統(tǒng)計學(xué)分析統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件,計量資料以(?)表示,組間比較采用單因素x~2檢驗,P0.05為差異。2實驗結(jié)果2.1 UCMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定倒置顯微鏡下觀察組織塊貼壁培養(yǎng)3-5天后開始有少量長梭形細胞爬出,培養(yǎng)7d后細胞融合達90%,呈漩渦狀或者平行排列貼壁生長,雜細胞較少,傳代后細胞較均一,形態(tài)規(guī)則,呈長梭形,增殖快,常于傳代后2d再次接近融合狀態(tài)。流式細胞學(xué)技術(shù)檢測UCMSCs表達中胚層來源分子CD73及分子CD29,陽性率分別為62.9%、95.5%,表達內(nèi)皮細胞特征分子CD31,陽性率為0.221%,表達造血干細胞系特征分子CD45,陽性率為0.186%,表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1,陽性率為0.946%,符合UCMSCs的特征。2.2 PGCs的分離培養(yǎng)及鑒定倒置顯微鏡下觀察生殖嵴組織塊3-5天開始爬出貼壁細胞,5-7天細胞能生長至70%~80%融合,細胞輪廓清楚,排列緊密,大部分細胞形態(tài)為核質(zhì)比較大的圓形或者橢圓形細胞。至80%左右融合狀態(tài)時進行傳代,傳代后細胞增殖迅速,常于傳代后3天再次接近融合狀態(tài)。AP染色細胞持續(xù)陽性,表明為含有堿性磷酸酶活性陽性的胚胎原始生殖細胞。流式細胞學(xué)技術(shù)檢測PGCs表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1,陽性率為92.5%,表達階段特異性胚胎抗原SSEA-4,陽性率為0.71%,符合小鼠PGCs的特征。2.3 PGCs的生物學(xué)特性研究通過細胞免疫熒光染色及RT-PCR檢測可發(fā)現(xiàn),Oct4、Stra8、Vasa、Scp3、Zp3均為陽性表達,表明我們所培養(yǎng)的PGCs是一種來自小鼠胚胎早期的胚胎生殖細胞,處于未分化狀態(tài),而且在體外培養(yǎng)過程中可進入減數(shù)分裂I期。2.4誘導(dǎo)UCMSCs向PGCLCs分化及鑒定倒置顯微鏡下觀察實驗組:經(jīng)過向PGCLCs誘導(dǎo)7d-9d后,開始出現(xiàn)部分核質(zhì)比大的圓形或橢圓形細胞,對照組細胞仍然保持長梭形形態(tài)。貼壁培養(yǎng)14d后,實驗組細胞穩(wěn)定表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1,陽性率為73.83%,且表達階段特異性胚胎抗原SSEA-3,陽性率為66.66%,對照組細胞表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1及SSEA-3,陽性率分別為0.69%、0.45%,證明實驗組細胞已部分向PGCLCs分化。2.5 Western blot檢測UCMSCs向卵母細胞分化情況結(jié)果顯示,共培養(yǎng)14d后,實驗組1的SCP3蛋白表達水平為0.566622±0.008407,實驗組2的SCP3蛋白表達水平為0.271562±0.041784,對照組的SCP3蛋白表達水平為0.130108±0.022316,三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其中任意兩組分別對比也均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3結(jié)論1.分離培養(yǎng)了純度較高的UCMSCs;2.分離培養(yǎng)了純度較高的PGCs;3.PGCs于體外可進行持續(xù)培養(yǎng),體外培養(yǎng)過程中可進入減數(shù)分裂I期;4.UCMSCs于體外可誘導(dǎo)分化為PGCLCs;5.共培養(yǎng)可體外誘導(dǎo)UCMSCs向卵母細胞方向進行分化。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶基質(zhì)干細胞 小鼠原始生殖細胞 細胞共培養(yǎng) 分化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R321
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 臍帶基質(zhì)干細胞的分離與鑒定14-20
• 2.1 實驗材料與方法14-16
• 2.2 實驗結(jié)果16-18
• 2.3 討論18-19
• 2.4 小結(jié)19-20
• 第三章 原始生殖細胞的分離及其生物學(xué)特性研究20-31
• 3.1 實驗材料與方法20-26
• 3.2 實驗結(jié)果26-29
• 3.3 討論29-30
• 3.4 小結(jié)30-31
• 第四章 臍帶基質(zhì)干細胞向生殖細胞分化的研究31-43
• 4.1 實驗材料與方法31-38
• 4.2 實驗結(jié)果38-41
• 4.3 討論41-42
• 4.4 小結(jié)42-43
• 全文總結(jié)43-44
• 參考文獻44-50
• 文獻綜述 干細胞向生殖細胞分化的研究進展50-58
• 參考文獻55-58
• 碩士期間發(fā)表文章58-59
• 致謝59

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