本文關(guān)鍵詞：Let-7a對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖、遷移、神經(jīng)分化的影響

  更多相關(guān)文章： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Let-7a Notch-1 HMGA2 增殖 遷移 神經(jīng)分化

【摘要】：背景與目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多胚層分化潛能,特定條件下可以分化為多種組織細(xì)胞。這為多種疾病的治療提供了更為廣闊的思路。Micro RNAs(mi RNAs)是生物體內(nèi)一種起調(diào)控作用的短小的單鏈非編碼RNA。let-7家族是其中較早發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)。其可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因組的表達(dá),參與BMSCs重要的生物學(xué)進(jìn)程。高遷移率族蛋白A2(High-mobility group A,HMGA2)作為高遷移率族蛋白家族(High—mobility group,HMG)成員之一,具有3個(gè)與DNA結(jié)合的特殊結(jié)構(gòu),可結(jié)合DNA并改變DNA空間構(gòu)象,調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄活性,參與細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)控。有研究表明,在腫瘤組織中,let-7可與HMGA2 3’UTR結(jié)合,負(fù)向調(diào)控該基因的表達(dá),抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Notch信號(hào)通路廣泛的分布于各種生物體內(nèi),具有高度的保守性,是影響細(xì)胞命運(yùn)的重要信號(hào)通路之一,對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡都有影響。研究發(fā)現(xiàn)micro RNAs能參與Notch信號(hào)通路的調(diào)控,二者在很多生命進(jìn)程中存在交互聯(lián)系。近年來(lái)對(duì)于Micro RNA家族中Let-7的研究層出不窮,但Let-7a對(duì)于BMSCs增殖、遷移、神經(jīng)分化的作用不甚清晰。本研究通過(guò)構(gòu)建let-7a上調(diào)及下調(diào)慢病毒載體,將其轉(zhuǎn)染BMSCs來(lái)研究不同表達(dá)水平的Let-7a對(duì)BMSCs體外增殖、遷移、神經(jīng)分化的影響,及其與HMGA2的表達(dá)水平、Notch信號(hào)通路的關(guān)系。為移植治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)。材料與方法1構(gòu)建大鼠let-7a-up慢病毒載體(LV-rno-let-7a-up和EGFP)、let-7a-inhibition慢病毒載體(LV-rno-let-7a-inhibition和EGFP)、空白慢病毒載體(只含有EGFP)。從大鼠股骨和脛骨分離培養(yǎng)BMSCs。篩選最適轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(multiply of infection,MOI)并對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組:轉(zhuǎn)染上調(diào)組:轉(zhuǎn)染let-7a-up慢病毒;轉(zhuǎn)染下調(diào)組:轉(zhuǎn)染let-7a-inhibition慢病毒;陰性轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染空白慢病毒;未轉(zhuǎn)染組:不進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。2使用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的熒光表達(dá)情況,評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。采用q RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的let-7a表達(dá)水平。3免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞高遷移率族蛋白2(high mobility group-AT-hook 2,HMGA2)的表達(dá)水平;MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力;transwell遷移實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力;4法舒地爾誘導(dǎo)各組細(xì)胞促使其神經(jīng)分化,免疫組化法檢測(cè)誘導(dǎo)后各組細(xì)胞神經(jīng)元烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白(microtubule associated protein 2,MAP-2)的表達(dá)差異;q RT-PCR、Western blot比較誘導(dǎo)后各組細(xì)胞Notch-1在基因和蛋白表達(dá)水平上的差異。5使用分析軟件預(yù)測(cè)Let-7a與Notch-1基因的結(jié)合調(diào)控區(qū),并進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè);使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)檢測(cè)Let-7a對(duì)Notch-1的靶向調(diào)節(jié)作用。6側(cè)腦室移植PKH26標(biāo)記的BMSCs,第2天及2周后倒置熒光顯微鏡下觀察其在SD大鼠腦內(nèi)的存活分布情況。結(jié)果1陽(yáng)性克隆PCR證明,let-7a-up慢病毒載體、let-7a-inhibition慢病毒載體、空白慢病毒載體構(gòu)建成功,孔稀釋法測(cè)定病毒滴度分別3×108TU/L、3×108TU/L和6×108TU/L。2倒置熒光顯微鏡下觀察let-7a-up慢病毒、let-7a-inhibition慢病毒、空白慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs成功。以轉(zhuǎn)染后第5天EGFP表達(dá)最佳。最適MOI為20。與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染上調(diào)組let-7a的表達(dá)水平顯著升高(P0.05),轉(zhuǎn)染下調(diào)組細(xì)胞let-7a的表達(dá)水平顯著降低(P0.05),陰性轉(zhuǎn)染組let-7a的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P0.05);3轉(zhuǎn)染上調(diào)組細(xì)胞HMGA2表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力及遷移能力均較未轉(zhuǎn)染組降低(P0.05);轉(zhuǎn)染下調(diào)組HMGA2表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力及遷移能力均較未轉(zhuǎn)染組增強(qiáng)(P0.05);陰性轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯差異(P0.05)。4法舒地爾誘導(dǎo)各組細(xì)胞神經(jīng)分化,與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染上調(diào)組神經(jīng)分化效率增強(qiáng),NSE、MAP-2表達(dá)水平升高,Notch-1及Notch-1 m RNA表達(dá)水平下降(P0.05);而轉(zhuǎn)染下調(diào)組反之(P0.05);陰性轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯差異(P0.05)。5 Target預(yù)測(cè)顯示Notch-1基因3’UTR區(qū)存在let-7a結(jié)合位點(diǎn)。測(cè)序結(jié)果表明Notch-1基因3’UTR區(qū)野生型/突變型報(bào)告基因載體構(gòu)建成功;檢測(cè)表明野生型報(bào)告基因載體與let-7a共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性較對(duì)照組顯著減低(P0.05);其他各組較對(duì)照組無(wú)明顯差異(P0.05)。6移植后腦切片顯示第2天PKH26陽(yáng)性的細(xì)胞呈團(tuán)分布在側(cè)腦室,2周后仍有存活并沿側(cè)腦室分布。結(jié)論1 let-7a可抑制BMSCs增殖活性及遷移能力。其可能通過(guò)下調(diào)HMGA2表達(dá)水平而發(fā)揮抑制作用。2 Let-7a可促進(jìn)BMSCs神經(jīng)分化;Notch-1是let-7a的靶基因之一,let-7a可能通過(guò)靶向抑制Notch信號(hào)通路而促進(jìn)神經(jīng)分化。3側(cè)腦室注射顯示注入的BMSCs在大鼠腦內(nèi)2周后依然存活并沿側(cè)腦室分布。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Let-7a Notch-1 HMGA2 增殖 遷移 神經(jīng)分化
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 中英文縮略表12-13
• 前言13-16
• 材料與方法16-32
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-36
• 討論36-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 附表與圖45-52
• 綜述 Let-7a的研究進(jìn)展52-65
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 附錄 個(gè)人簡(jiǎn)歷及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果65-66
• 致謝66

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本文編號(hào)：960955