本文關(guān)鍵詞：Let-7a對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖、遷移、神經(jīng)分化的影響

  更多相關(guān)文章： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Let-7a Notch-1 HMGA2 增殖 遷移 神經(jīng)分化

【摘要】：背景與目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多胚層分化潛能,特定條件下可以分化為多種組織細(xì)胞。這為多種疾病的治療提供了更為廣闊的思路。Micro RNAs(mi RNAs)是生物體內(nèi)一種起調(diào)控作用的短小的單鏈非編碼RNA。let-7家族是其中較早發(fā)現(xiàn)的一類。其可以通過轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因組的表達(dá),參與BMSCs重要的生物學(xué)進(jìn)程。高遷移率族蛋白A2(High-mobility group A,HMGA2)作為高遷移率族蛋白家族(High—mobility group,HMG)成員之一,具有3個與DNA結(jié)合的特殊結(jié)構(gòu),可結(jié)合DNA并改變DNA空間構(gòu)象,調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄活性,參與細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)控。有研究表明,在腫瘤組織中,let-7可與HMGA2 3’UTR結(jié)合,負(fù)向調(diào)控該基因的表達(dá),抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Notch信號通路廣泛的分布于各種生物體內(nèi),具有高度的保守性,是影響細(xì)胞命運(yùn)的重要信號通路之一,對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡都有影響。研究發(fā)現(xiàn)micro RNAs能參與Notch信號通路的調(diào)控,二者在很多生命進(jìn)程中存在交互聯(lián)系。近年來對于Micro RNA家族中Let-7的研究層出不窮,但Let-7a對于BMSCs增殖、遷移、神經(jīng)分化的作用不甚清晰。本研究通過構(gòu)建let-7a上調(diào)及下調(diào)慢病毒載體,將其轉(zhuǎn)染BMSCs來研究不同表達(dá)水平的Let-7a對BMSCs體外增殖、遷移、神經(jīng)分化的影響,及其與HMGA2的表達(dá)水平、Notch信號通路的關(guān)系。為移植治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)。材料與方法1構(gòu)建大鼠let-7a-up慢病毒載體(LV-rno-let-7a-up和EGFP)、let-7a-inhibition慢病毒載體(LV-rno-let-7a-inhibition和EGFP)、空白慢病毒載體(只含有EGFP)。從大鼠股骨和脛骨分離培養(yǎng)BMSCs。篩選最適轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(multiply of infection,MOI)并對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗分組:轉(zhuǎn)染上調(diào)組:轉(zhuǎn)染let-7a-up慢病毒;轉(zhuǎn)染下調(diào)組:轉(zhuǎn)染let-7a-inhibition慢病毒;陰性轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染空白慢病毒;未轉(zhuǎn)染組:不進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。2使用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的熒光表達(dá)情況,評價轉(zhuǎn)染效率。采用q RT-PCR檢測各組細(xì)胞的let-7a表達(dá)水平。3免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組細(xì)胞高遷移率族蛋白2(high mobility group-AT-hook 2,HMGA2)的表達(dá)水平;MTT比色法檢測各組細(xì)胞增殖活力;transwell遷移實驗及劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力;4法舒地爾誘導(dǎo)各組細(xì)胞促使其神經(jīng)分化,免疫組化法檢測誘導(dǎo)后各組細(xì)胞神經(jīng)元烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白(microtubule associated protein 2,MAP-2)的表達(dá)差異;q RT-PCR、Western blot比較誘導(dǎo)后各組細(xì)胞Notch-1在基因和蛋白表達(dá)水平上的差異。5使用分析軟件預(yù)測Let-7a與Notch-1基因的結(jié)合調(diào)控區(qū),并進(jìn)行靶基因預(yù)測;使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬頇z測Let-7a對Notch-1的靶向調(diào)節(jié)作用。6側(cè)腦室移植PKH26標(biāo)記的BMSCs,第2天及2周后倒置熒光顯微鏡下觀察其在SD大鼠腦內(nèi)的存活分布情況。結(jié)果1陽性克隆PCR證明,let-7a-up慢病毒載體、let-7a-inhibition慢病毒載體、空白慢病毒載體構(gòu)建成功,孔稀釋法測定病毒滴度分別3×108TU/L、3×108TU/L和6×108TU/L。2倒置熒光顯微鏡下觀察let-7a-up慢病毒、let-7a-inhibition慢病毒、空白慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs成功。以轉(zhuǎn)染后第5天EGFP表達(dá)最佳。最適MOI為20。與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染上調(diào)組let-7a的表達(dá)水平顯著升高(P0.05),轉(zhuǎn)染下調(diào)組細(xì)胞let-7a的表達(dá)水平顯著降低(P0.05),陰性轉(zhuǎn)染組let-7a的表達(dá)水平無明顯差異(P0.05);3轉(zhuǎn)染上調(diào)組細(xì)胞HMGA2表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力及遷移能力均較未轉(zhuǎn)染組降低(P0.05);轉(zhuǎn)染下調(diào)組HMGA2表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力及遷移能力均較未轉(zhuǎn)染組增強(qiáng)(P0.05);陰性轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組無明顯差異(P0.05)。4法舒地爾誘導(dǎo)各組細(xì)胞神經(jīng)分化,與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染上調(diào)組神經(jīng)分化效率增強(qiáng),NSE、MAP-2表達(dá)水平升高,Notch-1及Notch-1 m RNA表達(dá)水平下降(P0.05);而轉(zhuǎn)染下調(diào)組反之(P0.05);陰性轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組無明顯差異(P0.05)。5 Target預(yù)測顯示Notch-1基因3’UTR區(qū)存在let-7a結(jié)合位點。測序結(jié)果表明Notch-1基因3’UTR區(qū)野生型/突變型報告基因載體構(gòu)建成功;檢測表明野生型報告基因載體與let-7a共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性較對照組顯著減低(P0.05);其他各組較對照組無明顯差異(P0.05)。6移植后腦切片顯示第2天PKH26陽性的細(xì)胞呈團(tuán)分布在側(cè)腦室,2周后仍有存活并沿側(cè)腦室分布。結(jié)論1 let-7a可抑制BMSCs增殖活性及遷移能力。其可能通過下調(diào)HMGA2表達(dá)水平而發(fā)揮抑制作用。2 Let-7a可促進(jìn)BMSCs神經(jīng)分化;Notch-1是let-7a的靶基因之一,let-7a可能通過靶向抑制Notch信號通路而促進(jìn)神經(jīng)分化。3側(cè)腦室注射顯示注入的BMSCs在大鼠腦內(nèi)2周后依然存活并沿側(cè)腦室分布。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Let-7a Notch-1 HMGA2 增殖 遷移 神經(jīng)分化
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 中英文縮略表12-13
• 前言13-16
• 材料與方法16-32
• 實驗結(jié)果32-36
• 討論36-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 附表與圖45-52
• 綜述 Let-7a的研究進(jìn)展52-65
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 附錄 個人簡歷及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果65-66
• 致謝66

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1 王柏翎,李強(qiáng),劉慶華;神經(jīng)發(fā)育過程中的分子機(jī)制[J];高師理科學(xué)刊;2004年02期

2 蒙超衡,石德順,韋力,黃奔,韋精衛(wèi);小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化的方法比較研究[J];廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué);2004年04期

3 文玉軍;何玲;秦毅;;骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性及其神經(jīng)分化潛能[J];寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2006年06期

4 陸江琴;p19細(xì)胞神經(jīng)分化研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊;2001年06期

5 靳冰;吳麗穎;范明;;P19細(xì)胞神經(jīng)分化研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2006年02期

6 湯富酬,韓嶸,薛友紡,尚克剛;不同ES細(xì)胞系體外定量神經(jīng)分化的比較[J];遺傳;2001年05期

7 畢迎立;范建中;陳銀海;;氦-氖激光對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長及神經(jīng)分化潛能的作用[J];中國腦血管病雜志;2012年06期

8 李云濤;李橋川;邱錄貴;;臍帶血來源干細(xì)胞神經(jīng)分化的研究進(jìn)展[J];中國生物工程雜志;2006年06期

9 何丁文;殷明;鄔亞華;周榮平;魏強(qiáng)強(qiáng);殷嫦嫦;;Wnt/β-catenin信號通路在大鼠BMSCs神經(jīng)分化中的作用研究[J];中國生物工程雜志;2013年03期

10 楊靖,孫紅,邊瑋,景乃禾;過量表達(dá)Wnt-1基因誘導(dǎo)P19細(xì)胞的神經(jīng)分化[J];生理學(xué)報;1998年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 劉穎;劉麗梅;殷玉鵬;唐博;李子義;;丙戊酸對豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長及神經(jīng)分化的作用[A];中國解剖學(xué)會2013年年會論文文摘匯編[C];2013年

2 鄭國璽;祝康;朱珠;夏翠;;成年大鼠毛囊真皮乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng)與成神經(jīng)分化潛能[A];全國耳鼻咽喉頭頸外科中青年學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

3 安杰;袁泉;唐珂;許根俊;景乃禾;趙輔昆;;與P19細(xì)胞神經(jīng)分化有關(guān)的蛋白質(zhì)組的研究[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

4 張賽;;BDNF對低溫移植干細(xì)胞的環(huán)境營養(yǎng)與促神經(jīng)分化作用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

5 張?zhí)K明;梁燕玲;常麗英;梅愛農(nóng);魯文果;孟憲芳;;突觸蛋白-Ⅰ在胚胎干細(xì)胞的體外神經(jīng)分化過程中的作用[A];第九次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2006年

6 李莎莎;束曉梅;;腺病毒介導(dǎo)的心肌營養(yǎng)素-1對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化中細(xì)胞存活的作用[A];2013年貴州省兒科學(xué)術(shù)年會暨兒科常見疑難重癥診治繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班論文集[C];2013年

7 趙艷春;辛潔;孫春暉;趙寶祥;趙靜;蘇樂;;黃樟素氧化物誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞[A];“細(xì)胞活動 生命活力”——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會全體會員代表大會暨第十二次學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2011年

8 李玉宇;徐劍文;;缺氧對新生鼠腦細(xì)胞增殖和神經(jīng)分化的影響[A];中國解剖學(xué)會2011年年會論文文摘匯編[C];2011年

9 李澤桂;魏玲;李紅麗;蔡文琴;;JNK信號通路在胚胎干細(xì)胞體外神經(jīng)分化中的作用[A];Proceedings of the 7th Biennial Meeting and the 5th Congress of the Chinese Society for Neuroscience[C];2007年

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1 記者 李穎邋通訊員 崔瑩;胚胎發(fā)育早期神經(jīng)分化的“開關(guān)”發(fā)現(xiàn)[N];科技日報;2007年

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1 賈謙;長非編碼RNA-ANCR對三種牙源性干細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 蒙超衡;小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及神經(jīng)分化的研究[D];廣西大學(xué);2004年

3 劉磊;NSSR1在神經(jīng)分化中的表達(dá)調(diào)控及功能研究[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

4 龔敏;視黃酸核受體β介導(dǎo)的ATRA對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)分化促進(jìn)作用的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

5 劉媛;P19細(xì)胞神經(jīng)分化模型中NSPc1的靶基因鑒定[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2009年

6 唐珂;神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)重要功能基因的研究[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2002年

7 章恩明;胚胎干細(xì)胞同步化處理、神經(jīng)分化及Aβ對分化神經(jīng)元NFκB通路的影響[D];浙江大學(xué);2005年

8 戴津潑;RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞神經(jīng)分化中組蛋白去甲基酶Jmjd3對Mash1基因表達(dá)的調(diào)控作用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

9 呂建yN;SirT7在RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞神經(jīng)分化過程中的功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

10 劉雁平;NOV基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大鼠真皮多能干細(xì)胞成神經(jīng)分化中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

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1 許磊;利用胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化模型對多溴聯(lián)苯醚神經(jīng)發(fā)育毒性機(jī)制的研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2015年

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3 鐘毅;鐵蛋白基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)分化中的可誘導(dǎo)表達(dá)及MR成像[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

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8 高慧麗;阿爾茨海默病小鼠模型中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)分化[D];鄭州大學(xué);2014年

9 張俊克;血小板源性生長因子對成神經(jīng)分化的間充質(zhì)干細(xì)胞定向遷移研究[D];蘇州大學(xué);2010年

10 包普花;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成神經(jīng)分化過程中的定向遷移研究[D];蘇州大學(xué);2009年

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本文編號：960955