本文關(guān)鍵詞：重組人源性脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)的表達(dá)、純化與活性檢測(cè)

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【摘要】：目的:利用基因工程方法構(gòu)建人源性脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)(gAd)基因的高效原核表達(dá)體系,并對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化、鑒定及活性檢測(cè)。方法:從正常人脂肪組織里面提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切后連入pET-22b(+)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b(+)-gAd,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后目的蛋白以包涵體形式產(chǎn)生,采用強(qiáng)堿促溶包涵體并用丙酮沉淀蛋白的方法進(jìn)行復(fù)性和純化,得到高純度的人源性gAd。運(yùn)用SDS-PAGE、Western blotting對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定,通過對(duì)蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和對(duì)小鼠的心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用來檢測(cè)純化蛋白的生物學(xué)活性。結(jié)果:成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-22b(+)-gAd,實(shí)現(xiàn)了人源性gAd在原核細(xì)胞中的表達(dá),并對(duì)形成的包涵體變性、復(fù)性和純化,純化出的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE和Western分析證實(shí)為gAd;通過對(duì)AMPK的磷酸化水平的檢測(cè)和對(duì)小鼠的心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用證明純化出的gAd具有高生物學(xué)活性。結(jié)論:成功構(gòu)建、表達(dá)和純化了無標(biāo)簽、高生物學(xué)活性的人源性脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)(gAd),為其進(jìn)一步的理論研究、生產(chǎn)開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院;第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物技術(shù)中心;
【關(guān)鍵詞】： 重組人脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu) 表達(dá)純化 心臟保護(hù)
【基金】：國家重大新藥創(chuàng)制(2009ZX09103-673) 國家自然科學(xué)基金(81170186、81100136) 新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(2011SXJ01)資助項(xiàng)目
【分類號(hào)】：R341
【正文快照】： 脂聯(lián)素主要是由脂肪細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子,是一種與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的血漿蛋白,具有調(diào)節(jié)血糖、血脂,抗炎及改善血管內(nèi)皮功能等多種作用,其含量和活性改變與肥胖、2型糖尿病(T2DM)、心血管疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系[1-2]。研究表明,給予外源性脂聯(lián)素能夠改善糖尿病動(dòng)物胰島

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