本文關(guān)鍵詞：骨密質(zhì)碎片法分離培養(yǎng)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞及其生物學(xué)特性鑒定

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【摘要】：目的:建立一種從小鼠骨密質(zhì)中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的高效方法,并證實(shí)骨密質(zhì)來(lái)源MSCs具有成骨、成脂肪和成軟骨的多向分化能力。方法:采取骨片法從C57BL/6小鼠骨密質(zhì)中分離和純化MSCs,熒光倒置顯微鏡下直接觀察不同生長(zhǎng)時(shí)期MSCs形態(tài)學(xué)特征;流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)對(duì)其進(jìn)行免疫表型鑒定;取第5代MSCs進(jìn)行成骨、成脂肪和成軟骨定向誘導(dǎo)并作組織化學(xué)染色鑒定,RT-PCR方法檢測(cè)定向誘導(dǎo)后特異性基因表達(dá):骨特異性的骨鈣素(Osteocalcin,OCN)和骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)基因,脂肪特異性的脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LP)和脂肪酶(Adipsin)基因,軟骨特異性的Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)基因。結(jié)果:接種骨密質(zhì)碎片約24小時(shí)后即可見(jiàn)短梭狀細(xì)胞從骨碎片向周圍爬出,呈貼壁生長(zhǎng),經(jīng)3次傳代后即可獲得細(xì)胞形態(tài)均一、貼壁能力強(qiáng)、易于消化的梭形MSCs。第5代C57BL/6小鼠MSCs陽(yáng)性表達(dá)CD44(99.81%)、CD29(99.77%)、Sca-1(99.76%)和CD34(94.51%),陰性表達(dá)CD45(0.86%)和CD117(0.17%)。第5代MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后可成功的分化為骨、脂肪和軟骨細(xì)胞,相應(yīng)茜素紅、油紅O和阿利辛藍(lán)染色成陽(yáng)性,并分別表達(dá)骨特異性骨鈣素(Osteocalcin,OCN)和骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)基因,脂肪特異性脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LP)和脂肪酶(Adipsin)基因,軟骨特異性Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)基因。結(jié)論:經(jīng)骨密質(zhì)碎片法培養(yǎng)可以在較短時(shí)間內(nèi)分離出更高純度的MSCs,該方法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),穩(wěn)定性好,分離效率高,可重復(fù)性強(qiáng)。培養(yǎng)出的MSCs符合公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)(具有塑料粘附、特定的免疫表型和多向分化潛能)。
【作者單位】： 北京大學(xué)第一醫(yī)院血液科;
【關(guān)鍵詞】： 間充質(zhì)干細(xì)胞 骨密質(zhì) 細(xì)胞培養(yǎng) 鑒定 多向分化
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30940030,81070448)
【分類號(hào)】：R329
【正文快照】： 小鼠是研究MSCs生物學(xué)特征的理想模型,然而小鼠MSCs的分離與大鼠和其它物種相比要困難很多。不同品系小鼠在相同培養(yǎng)條件下,其粘附、增殖和分化能力也不盡相同[1]。常規(guī)的全骨髓貼壁和密度梯度離心等方法分離獲得的小鼠MSCs不僅含量很低,而且純度不夠,難以滿足實(shí)驗(yàn)研究的要求

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本文編號(hào)：853252