本文關(guān)鍵詞：Toll樣受體5激動劑CBLB502-Fc融合蛋白真核表達純化及其活性的初步研究

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【摘要】：Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類在機體固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用的模式識別受體,能夠特異性識別細菌、病毒等病原體相關(guān)分子模式。目前在哺乳動物細胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13種TLR,其中人TLRs家族有11種。TLR5作為TLRs家族中的一個成員,能夠通過特異性識別細菌鞭毛蛋白,激活固有免疫應(yīng)答。TLR5廣泛地分布于哺乳動物氣管、脾臟、肺、肝臟、腎臟、泌尿生殖道等的上皮細胞和樹突狀細胞的細胞膜上。當(dāng)TLR5特異性識別鞭毛蛋白,其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域會發(fā)生構(gòu)象變化,形成同源二聚體,并開始下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TLR5信號通路主要是My D88依賴性的,最終激活NF-κB、JNK和p38,誘導(dǎo)免疫炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯,促進細胞因子的分泌。TLR5激動劑CBLB502是由克利夫蘭生物實驗室研究開發(fā)的來源于沙門氏菌鞭毛蛋白改構(gòu)的蛋白藥物。經(jīng)過結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計后,CBLB502缺失了鞭毛蛋白具有高度免疫原性的中心球狀結(jié)構(gòu)域,包含了鞭毛蛋白N端和C端的功能結(jié)構(gòu)域,比鞭毛蛋白具有更低的免疫原性,但保留了激活TLR5的能力和抗輻射的功能。研究發(fā)現(xiàn),CBLB502具有緩解修復(fù)輻射或化學(xué)藥物引起的造血系統(tǒng)和胃腸道損傷,但其組織保護作用不會延伸至腫瘤。另外它對表達TLR5的腫瘤細胞具有直接細胞毒作用,并能動員免疫細胞至肝臟對肝轉(zhuǎn)移癌產(chǎn)生抗腫瘤作用。目前研究中所使用到的CBLB502均是由大腸桿菌表達純化。原核表達系統(tǒng)雖能夠高效地表達目的蛋白,但是常以包涵體形式存在,需變性復(fù)性處理后進行分離純化,且內(nèi)毒素及熱源不易除去,分離純化工藝較為復(fù)雜。因此,本課題擬利用真核表達獲得CBLB502與Ig G1 Fc片段的融合蛋白,以克服CBLB502原核表達的缺點,并且?guī)鞦c融合蛋白的優(yōu)點。CBLB502與Ig G1 Fc片段融合后,能夠簡化分離純化工藝。另外,融合Fc片段可以增大蛋白分子量,并且在新生的Fc受體的保護下,可以延長其血漿半衰期。并且Fc融合蛋白可以通過二硫鍵形成穩(wěn)定的二聚體,能夠提高蛋白分子的穩(wěn)定性。首先需要進行CBLB502-Fc真核表達載體的構(gòu)建。根據(jù)文獻報道中CBLB502的基因序列,優(yōu)化合成適宜在中國倉鼠卵巢細胞(chinese hamster ovary,CHO-S)翻譯表達的基因序列。經(jīng)PCR擴增CBLB502基因片段后,使用限制性內(nèi)切酶Avr II、Bam H I雙酶切目的基因片段,克隆至p UC57-Fc質(zhì)粒中。然后使用Eco R V、Hind III雙酶切pc DNA3.1和p UC57-CBLB502-Fc,將CBLB502-Fc基因片段克隆至載體pc DNA3.1,挑選陽性克隆并測序,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-S細胞,篩選高表達細胞系,并用ELISA檢測和免疫印跡鑒定表達情況。擴大培養(yǎng)后收集培養(yǎng)上清,利用Protein A親和柱純化目的蛋白,再對目的蛋白進行SDSPAGE鑒定。最終成功構(gòu)建得到了CBLB502-Fc真核表達載體。轉(zhuǎn)染CHO-S細胞后,篩選得到CBLB502-Fc高表達細胞系,并且純化得到較高純度的融合蛋白,為后續(xù)CBLB502-Fc的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。然后設(shè)計實驗對CBLB502-Fc融合蛋白體內(nèi)外活性進行了初步鑒定。通過檢測NF-κB核易位和JNK磷酸化,初步鑒定CBLB502-Fc的體外活性。利用20μg/m L CBLB502-Fc、20ng/m L的TNF-α(陽性對照)、10μg/m L CBLB502(陽性對照)和刺激經(jīng)饑餓處理的A549細胞20 min,收集細胞進行細胞核質(zhì)蛋白分離實驗,western blot檢測核質(zhì)分離情況和NF-κB核易位,同時進行細胞免疫熒光實驗觀察NF-κB核易位情況。結(jié)果顯示,核質(zhì)分離成功后,CBLB502-Fc不能激活NF-κB信號通路,免疫熒光結(jié)果與western blot結(jié)果一致。再利用上述相同實驗條件對A549細胞進行刺激,使用RIPA細胞裂解液裂解細胞,收集蛋白,進行western blot檢測JNK磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示,CBLB502-Fc同CBLB502一樣都能夠激活TLR5信號通路,然后激活JNK,提高其磷酸化水平。體內(nèi)活性實驗則是使用C57BL/6小鼠進行輻射存活實驗。在小鼠接受輻射前30min,腹腔注射給藥,分別注射生理鹽水、CBLB502(劑量為0.2mg/kg)、CBLB502-Fc低劑量(劑量為0.2mg/kg)和CBLB502-Fc高劑量(劑量為0.4mg/kg)。使用60Co-γ射線對小鼠進行8 Gy全身輻照,照射后,對小鼠進行30天的存活觀察。結(jié)果表明,CBLB502-Fc能夠顯著提高致死輻照的小鼠的存活率,且與CBLB502之間無顯著性差異。另外在小鼠地西他濱(Decitabine,DAC)急性毒性實驗中,CBLB502-Fc與CBLB502均能夠顯著延長小鼠存活時間。以上兩個小鼠存活實驗初步證明了CBLB502-Fc具有體內(nèi)生物學(xué)活性,對機體具有輻射保護作用和降低化藥的毒副作用。再結(jié)合體外細胞實驗結(jié)果,JNK信號通路可能在CBLB502與CBLB502-Fc生物學(xué)功能的發(fā)揮中起到重要作用。最后利用DAC建立小鼠骨髓抑制模型,研究CBLB502-Fc對于化藥引起的骨髓抑制的緩解作用以及對于小鼠的細胞表型的影響。將48只BALB/c小鼠隨機分為對照組、CBLB502組、CBLB502-Fc組、DAC組、DAC+CBLB502組、DAC+CBLB502-Fc組。按組對小鼠小鼠腹腔注射劑量為1 mg/kg的DAC,連續(xù)給藥3天。最后一次DAC給藥1 h后,按組注射生理鹽水、CBLB502(劑量為0.1 mg/kg)與CBLB502-Fc(劑量為0.2 mg/kg)。停止給藥3天后,重復(fù)一個給藥過程。解剖前一天,割小鼠尾靜脈取血檢測外周血象。最后對小鼠摘眼球取血,解剖取股骨骨髓。小鼠血液與骨髓樣品加入熒光標記單克隆抗體進行標記,再使用紅細胞裂解液裂解紅細胞,處理好的樣品進行流式細胞術(shù)分析。外周血象檢測結(jié)果顯示,經(jīng)過DAC處理的小鼠外周血象各項指標都顯著低于對照組的小鼠,表明成功建立了骨髓抑制小鼠模型。而CBLB502-Fc與CBLB502不能夠緩解DAC對于紅細胞、白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的抑制。但CBLB502-Fc能夠顯著緩解DAC對外周血血小板的抑制。這表示CBLB502-Fc對于骨髓抑制具有一定的緩解作用。另外,CBLB502與CBLB502-Fc能夠顯著促進中性粒細胞的增殖。流式檢測發(fā)現(xiàn),相比對照小鼠,DAC給藥后的骨髓抑制小鼠外周血與骨髓CD4+、CD8a+、CD4+/CD8a+T淋巴細胞和CD3e+、NK、NKT細胞均顯著升高,而CD11b+細胞顯著下降。CBLB502與CBLB502-Fc都能夠顯著降低小鼠外周血CD4+、CD8a+、CD4+/CD8a+T淋巴細胞,顯著升高外周血與骨髓中CD11b+細胞,另外能夠升高外周血中NK與NKT細胞。對于骨髓抑制小鼠,CBLB502與CBLB502-Fc能夠顯著升高外周血中CD4+T淋巴細胞,降低外周血NK與NKT細胞,而對CD11b+細胞無明顯作用。另外CBLB502顯著升高骨髓抑制小鼠骨髓中NK與NKT細胞,而CBLB502-Fc能夠顯著降低骨髓抑制小鼠骨髓中CD4+、CD4+/CD8a+T淋巴細胞。結(jié)果表明CBLB502-Fc對于小鼠CD4+和CD8a+細胞、NK與NKT細胞和CD11b+細胞的影響與CBLB502相一致,都能夠使機體產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答,促進NK細胞、NKT細胞和CD11b+細胞的增殖。綜上所述,初步證明了CBLB502-Fc是具有與CBLB502相同生物學(xué)活性的融合蛋白,具有輻射防護作用和骨髓保護作用。而CBLB502-Fc作用的信號通路及其功能機制值得進一步的研究與探討。
【關(guān)鍵詞】：Toll樣受體5 CBLB502-Fc 融合蛋白 骨髓抑制 抗輻射
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 縮略詞表6-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-21
• 1. TLR5的蛋白結(jié)構(gòu)及分布15-16
• 2. TLR5的信號通路16-17
• 3. TLR5生理功能的研究17-18
• 4. TLR5激動劑18
• 5. 鞭毛蛋白衍生物CBLB50218-21
• 第一部分 CBLB502-Fc 真核表達載體的構(gòu)建、表達與純化21-36
• 1. 實驗材料、試劑和儀器設(shè)備21-24
• 1.1 質(zhì)粒、感受態(tài)和細胞株21
• 1.2 主要試劑及耗材21-22
• 1.3 主要試劑配制22-23
• 1.4 主要儀器設(shè)備23-24
• 2. 方法24-29
• 2.1 CBLB502目的基因的獲得24
• 2.2 pcDNA3.1-CBLB502-Fc真核表達載體的構(gòu)建24-26
• 2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細胞26
• 2.4 表達CBLB502-Fc的CHO-S細胞的單克隆篩選及WB驗證26-27
• 2.5 CBLB502-Fc融合蛋白的表達純化27-28
• 2.6 SDS-PAGE檢測目的蛋白及考馬斯亮藍快速染色28-29
• 3. 結(jié)果29-33
• 3.1 CBLB502目的基因的優(yōu)化合成29-30
• 3.2 pcDNA3.1-CBLB502-Fc質(zhì)粒的構(gòu)建30-31
• 3.3 pcDNA3.1-CBLB502-Fc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細胞31
• 3.4 陽性細胞克隆的篩選和WB驗證31-32
• 3.5 Protein A親和柱純化目的蛋白32-33
• 3.6 目的蛋白的SDS-PAGE鑒定及考馬斯亮藍染色結(jié)果33
• 4 討論與分析33-35
• 5. 小結(jié)35-36
• 第二部分 CBLB502-Fc融合蛋白體內(nèi)外活性的初步鑒定36-45
• 1. 實驗動物、材料與試劑36-37
• 1.1 細胞株和動物36
• 1.2 主要試劑及耗材36-37
• 2. 方法37-39
• 2.1 CBLB502-Fc激活TLR5-NF-κB信號通路的研究37-38
• 2.2 檢測CBLB502-Fc對JNK激活情況38
• 2.3 CBLB502-Fc對小鼠輻射防護作用的研究38-39
• 2.4 CBLB502-Fc對注射高劑量DAC的小鼠存活率的影響39
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析39
• 3. 結(jié)果39-42
• 3.1 CBLB502-Fc不激活NF-κB信號通路39-41
• 3.2 CBLB502-Fc提高JNK的磷酸化水平41
• 3.3 CBLB502-Fc顯著提高 γ 射線照射后小鼠的生存率41-42
• 3.4 CBLB502-Fc延長注射高劑量DAC的小鼠存活時間42
• 4. 討論與分析42-44
• 5. 小結(jié)44-45
• 第三部分 CBLB502-Fc緩解骨髓抑制的初步研究45-56
• 1. 實驗動物、材料和試劑45
• 1.1 動物45
• 1.2 主要試劑及耗材45
• 1.3 主要試劑配制45
• 2. 方法45-46
• 2.1 CBLB502-Fc影響小鼠骨髓抑制的初步動物實驗及外周血象檢測45-46
• 2.2 小鼠外周血與骨髓進行流式細胞分析46
• 2.3 統(tǒng)計與分析46
• 3. 結(jié)果46-52
• 3.1 CBLB502-Fc對于普通和骨髓抑制小鼠外周血象的影響46-47
• 3.2 小鼠外周血與骨髓的流式細胞分析的結(jié)果47-52
• 4. 討論與分析52-55
• 5. 小結(jié)55-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-61
• 附錄61-62
• 個人簡歷62-63
• 致謝63

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本文編號：831675