本文關(guān)鍵詞：Toll樣受體5激動(dòng)劑CBLB502-Fc融合蛋白真核表達(dá)純化及其活性的初步研究

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【摘要】：Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類在機(jī)體固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用的模式識(shí)別受體,能夠特異性識(shí)別細(xì)菌、病毒等病原體相關(guān)分子模式。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13種TLR,其中人TLRs家族有11種。TLR5作為TLRs家族中的一個(gè)成員,能夠通過特異性識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白,激活固有免疫應(yīng)答。TLR5廣泛地分布于哺乳動(dòng)物氣管、脾臟、肺、肝臟、腎臟、泌尿生殖道等的上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜上。當(dāng)TLR5特異性識(shí)別鞭毛蛋白,其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化,形成同源二聚體,并開始下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TLR5信號(hào)通路主要是My D88依賴性的,最終激活NF-κB、JNK和p38,誘導(dǎo)免疫炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯,促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌。TLR5激動(dòng)劑CBLB502是由克利夫蘭生物實(shí)驗(yàn)室研究開發(fā)的來源于沙門氏菌鞭毛蛋白改構(gòu)的蛋白藥物。經(jīng)過結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)后,CBLB502缺失了鞭毛蛋白具有高度免疫原性的中心球狀結(jié)構(gòu)域,包含了鞭毛蛋白N端和C端的功能結(jié)構(gòu)域,比鞭毛蛋白具有更低的免疫原性,但保留了激活TLR5的能力和抗輻射的功能。研究發(fā)現(xiàn),CBLB502具有緩解修復(fù)輻射或化學(xué)藥物引起的造血系統(tǒng)和胃腸道損傷,但其組織保護(hù)作用不會(huì)延伸至腫瘤。另外它對(duì)表達(dá)TLR5的腫瘤細(xì)胞具有直接細(xì)胞毒作用,并能動(dòng)員免疫細(xì)胞至肝臟對(duì)肝轉(zhuǎn)移癌產(chǎn)生抗腫瘤作用。目前研究中所使用到的CBLB502均是由大腸桿菌表達(dá)純化。原核表達(dá)系統(tǒng)雖能夠高效地表達(dá)目的蛋白,但是常以包涵體形式存在,需變性復(fù)性處理后進(jìn)行分離純化,且內(nèi)毒素及熱源不易除去,分離純化工藝較為復(fù)雜。因此,本課題擬利用真核表達(dá)獲得CBLB502與Ig G1 Fc片段的融合蛋白,以克服CBLB502原核表達(dá)的缺點(diǎn),并且?guī)鞦c融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)。CBLB502與Ig G1 Fc片段融合后,能夠簡(jiǎn)化分離純化工藝。另外,融合Fc片段可以增大蛋白分子量,并且在新生的Fc受體的保護(hù)下,可以延長(zhǎng)其血漿半衰期。并且Fc融合蛋白可以通過二硫鍵形成穩(wěn)定的二聚體,能夠提高蛋白分子的穩(wěn)定性。首先需要進(jìn)行CBLB502-Fc真核表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道中CBLB502的基因序列,優(yōu)化合成適宜在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(chinese hamster ovary,CHO-S)翻譯表達(dá)的基因序列。經(jīng)PCR擴(kuò)增CBLB502基因片段后,使用限制性內(nèi)切酶Avr II、Bam H I雙酶切目的基因片段,克隆至p UC57-Fc質(zhì)粒中。然后使用Eco R V、Hind III雙酶切pc DNA3.1和p UC57-CBLB502-Fc,將CBLB502-Fc基因片段克隆至載體pc DNA3.1,挑選陽性克隆并測(cè)序,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞,篩選高表達(dá)細(xì)胞系,并用ELISA檢測(cè)和免疫印跡鑒定表達(dá)情況。擴(kuò)大培養(yǎng)后收集培養(yǎng)上清,利用Protein A親和柱純化目的蛋白,再對(duì)目的蛋白進(jìn)行SDSPAGE鑒定。最終成功構(gòu)建得到了CBLB502-Fc真核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞后,篩選得到CBLB502-Fc高表達(dá)細(xì)胞系,并且純化得到較高純度的融合蛋白,為后續(xù)CBLB502-Fc的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。然后設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)CBLB502-Fc融合蛋白體內(nèi)外活性進(jìn)行了初步鑒定。通過檢測(cè)NF-κB核易位和JNK磷酸化,初步鑒定CBLB502-Fc的體外活性。利用20μg/m L CBLB502-Fc、20ng/m L的TNF-α(陽性對(duì)照)、10μg/m L CBLB502(陽性對(duì)照)和刺激經(jīng)饑餓處理的A549細(xì)胞20 min,收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核質(zhì)蛋白分離實(shí)驗(yàn),western blot檢測(cè)核質(zhì)分離情況和NF-κB核易位,同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察NF-κB核易位情況。結(jié)果顯示,核質(zhì)分離成功后,CBLB502-Fc不能激活NF-κB信號(hào)通路,免疫熒光結(jié)果與western blot結(jié)果一致。再利用上述相同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行刺激,使用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,收集蛋白,進(jìn)行western blot檢測(cè)JNK磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示,CBLB502-Fc同CBLB502一樣都能夠激活TLR5信號(hào)通路,然后激活JNK,提高其磷酸化水平。體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)則是使用C57BL/6小鼠進(jìn)行輻射存活實(shí)驗(yàn)。在小鼠接受輻射前30min,腹腔注射給藥,分別注射生理鹽水、CBLB502(劑量為0.2mg/kg)、CBLB502-Fc低劑量(劑量為0.2mg/kg)和CBLB502-Fc高劑量(劑量為0.4mg/kg)。使用60Co-γ射線對(duì)小鼠進(jìn)行8 Gy全身輻照,照射后,對(duì)小鼠進(jìn)行30天的存活觀察。結(jié)果表明,CBLB502-Fc能夠顯著提高致死輻照的小鼠的存活率,且與CBLB502之間無顯著性差異。另外在小鼠地西他濱(Decitabine,DAC)急性毒性實(shí)驗(yàn)中,CBLB502-Fc與CBLB502均能夠顯著延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間。以上兩個(gè)小鼠存活實(shí)驗(yàn)初步證明了CBLB502-Fc具有體內(nèi)生物學(xué)活性,對(duì)機(jī)體具有輻射保護(hù)作用和降低化藥的毒副作用。再結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果,JNK信號(hào)通路可能在CBLB502與CBLB502-Fc生物學(xué)功能的發(fā)揮中起到重要作用。最后利用DAC建立小鼠骨髓抑制模型,研究CBLB502-Fc對(duì)于化藥引起的骨髓抑制的緩解作用以及對(duì)于小鼠的細(xì)胞表型的影響。將48只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、CBLB502組、CBLB502-Fc組、DAC組、DAC+CBLB502組、DAC+CBLB502-Fc組。按組對(duì)小鼠小鼠腹腔注射劑量為1 mg/kg的DAC,連續(xù)給藥3天。最后一次DAC給藥1 h后,按組注射生理鹽水、CBLB502(劑量為0.1 mg/kg)與CBLB502-Fc(劑量為0.2 mg/kg)。停止給藥3天后,重復(fù)一個(gè)給藥過程。解剖前一天,割小鼠尾靜脈取血檢測(cè)外周血象。最后對(duì)小鼠摘眼球取血,解剖取股骨骨髓。小鼠血液與骨髓樣品加入熒光標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記,再使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,處理好的樣品進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。外周血象檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)過DAC處理的小鼠外周血象各項(xiàng)指標(biāo)都顯著低于對(duì)照組的小鼠,表明成功建立了骨髓抑制小鼠模型。而CBLB502-Fc與CBLB502不能夠緩解DAC對(duì)于紅細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的抑制。但CBLB502-Fc能夠顯著緩解DAC對(duì)外周血血小板的抑制。這表示CBLB502-Fc對(duì)于骨髓抑制具有一定的緩解作用。另外,CBLB502與CBLB502-Fc能夠顯著促進(jìn)中性粒細(xì)胞的增殖。流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn),相比對(duì)照小鼠,DAC給藥后的骨髓抑制小鼠外周血與骨髓CD4+、CD8a+、CD4+/CD8a+T淋巴細(xì)胞和CD3e+、NK、NKT細(xì)胞均顯著升高,而CD11b+細(xì)胞顯著下降。CBLB502與CBLB502-Fc都能夠顯著降低小鼠外周血CD4+、CD8a+、CD4+/CD8a+T淋巴細(xì)胞,顯著升高外周血與骨髓中CD11b+細(xì)胞,另外能夠升高外周血中NK與NKT細(xì)胞。對(duì)于骨髓抑制小鼠,CBLB502與CBLB502-Fc能夠顯著升高外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞,降低外周血NK與NKT細(xì)胞,而對(duì)CD11b+細(xì)胞無明顯作用。另外CBLB502顯著升高骨髓抑制小鼠骨髓中NK與NKT細(xì)胞,而CBLB502-Fc能夠顯著降低骨髓抑制小鼠骨髓中CD4+、CD4+/CD8a+T淋巴細(xì)胞。結(jié)果表明CBLB502-Fc對(duì)于小鼠CD4+和CD8a+細(xì)胞、NK與NKT細(xì)胞和CD11b+細(xì)胞的影響與CBLB502相一致,都能夠使機(jī)體產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答,促進(jìn)NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和CD11b+細(xì)胞的增殖。綜上所述,初步證明了CBLB502-Fc是具有與CBLB502相同生物學(xué)活性的融合蛋白,具有輻射防護(hù)作用和骨髓保護(hù)作用。而CBLB502-Fc作用的信號(hào)通路及其功能機(jī)制值得進(jìn)一步的研究與探討。
【關(guān)鍵詞】：Toll樣受體5 CBLB502-Fc 融合蛋白 骨髓抑制 抗輻射
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 縮略詞表6-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-21
• 1. TLR5的蛋白結(jié)構(gòu)及分布15-16
• 2. TLR5的信號(hào)通路16-17
• 3. TLR5生理功能的研究17-18
• 4. TLR5激動(dòng)劑18
• 5. 鞭毛蛋白衍生物CBLB50218-21
• 第一部分 CBLB502-Fc 真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與純化21-36
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器設(shè)備21-24
• 1.1 質(zhì)粒、感受態(tài)和細(xì)胞株21
• 1.2 主要試劑及耗材21-22
• 1.3 主要試劑配制22-23
• 1.4 主要儀器設(shè)備23-24
• 2. 方法24-29
• 2.1 CBLB502目的基因的獲得24
• 2.2 pcDNA3.1-CBLB502-Fc真核表達(dá)載體的構(gòu)建24-26
• 2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞26
• 2.4 表達(dá)CBLB502-Fc的CHO-S細(xì)胞的單克隆篩選及WB驗(yàn)證26-27
• 2.5 CBLB502-Fc融合蛋白的表達(dá)純化27-28
• 2.6 SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白及考馬斯亮藍(lán)快速染色28-29
• 3. 結(jié)果29-33
• 3.1 CBLB502目的基因的優(yōu)化合成29-30
• 3.2 pcDNA3.1-CBLB502-Fc質(zhì)粒的構(gòu)建30-31
• 3.3 pcDNA3.1-CBLB502-Fc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞31
• 3.4 陽性細(xì)胞克隆的篩選和WB驗(yàn)證31-32
• 3.5 Protein A親和柱純化目的蛋白32-33
• 3.6 目的蛋白的SDS-PAGE鑒定及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果33
• 4 討論與分析33-35
• 5. 小結(jié)35-36
• 第二部分 CBLB502-Fc融合蛋白體內(nèi)外活性的初步鑒定36-45
• 1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑36-37
• 1.1 細(xì)胞株和動(dòng)物36
• 1.2 主要試劑及耗材36-37
• 2. 方法37-39
• 2.1 CBLB502-Fc激活TLR5-NF-κB信號(hào)通路的研究37-38
• 2.2 檢測(cè)CBLB502-Fc對(duì)JNK激活情況38
• 2.3 CBLB502-Fc對(duì)小鼠輻射防護(hù)作用的研究38-39
• 2.4 CBLB502-Fc對(duì)注射高劑量DAC的小鼠存活率的影響39
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析39
• 3. 結(jié)果39-42
• 3.1 CBLB502-Fc不激活NF-κB信號(hào)通路39-41
• 3.2 CBLB502-Fc提高JNK的磷酸化水平41
• 3.3 CBLB502-Fc顯著提高 γ 射線照射后小鼠的生存率41-42
• 3.4 CBLB502-Fc延長(zhǎng)注射高劑量DAC的小鼠存活時(shí)間42
• 4. 討論與分析42-44
• 5. 小結(jié)44-45
• 第三部分 CBLB502-Fc緩解骨髓抑制的初步研究45-56
• 1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料和試劑45
• 1.1 動(dòng)物45
• 1.2 主要試劑及耗材45
• 1.3 主要試劑配制45
• 2. 方法45-46
• 2.1 CBLB502-Fc影響小鼠骨髓抑制的初步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及外周血象檢測(cè)45-46
• 2.2 小鼠外周血與骨髓進(jìn)行流式細(xì)胞分析46
• 2.3 統(tǒng)計(jì)與分析46
• 3. 結(jié)果46-52
• 3.1 CBLB502-Fc對(duì)于普通和骨髓抑制小鼠外周血象的影響46-47
• 3.2 小鼠外周血與骨髓的流式細(xì)胞分析的結(jié)果47-52
• 4. 討論與分析52-55
• 5. 小結(jié)55-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 附錄61-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷62-63
• 致謝63

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4 司成業(yè);基于融合蛋白構(gòu)建智能超分子組裝體[D];吉林大學(xué);2016年

5 范季瀛;候選藥物重組融合蛋白VAS-TRAIL的研究[D];華東理工大學(xué);2016年

6 高冬芳;纖維素酶作為融合蛋白在大腸桿菌中的應(yīng)用及其分泌機(jī)制的研究[D];山東大學(xué);2016年

7 宋琳琳;Ub-HBcAg-CTP融合蛋白誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];上海交通大學(xué);2015年

8 劉寶平;家蠶表達(dá)的霍亂病毒B亞基融合蛋白防治1型糖尿病和阿爾茨海默癥研究[D];浙江大學(xué);2015年

9 周小虎;線粒體融合蛋白2在肝細(xì)胞肝癌中作用機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2016年

10 陸遠(yuǎn);EGFR靶向單鏈抗體制備及介導(dǎo)siRNA內(nèi)化NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 郭海強(qiáng);p53~(N239S)蛋白的表達(dá)與純化以及癌基因Kras~(G12D)與p53~(236S)促進(jìn)小鼠罹患肺癌[D];昆明理工大學(xué);2015年

2 胡湘云;新城疫病毒融合蛋白納米抗體的篩選與鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

3 張銀閣;熒光標(biāo)記重組乙型肝炎病毒載體的構(gòu)建[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 彭金秀;結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染致T細(xì)胞功能障礙的研究及融合蛋白AEMD和LT70的構(gòu)建[D];蘭州大學(xué);2015年

5 崔連振;利用重組凝集素篩選腫瘤相關(guān)蛋白及其功能研究[D];浙江理工大學(xué);2016年

6 耿小雪;對(duì)蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26與細(xì)胞穿膜肽的融合蛋白在畢赤酵母中的組成型表達(dá)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

7 皇超英;NJA-1菌中DON降解酶基因的克隆、表達(dá)及特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 張冬冬;IL-1RA-PEP融合蛋白功能及對(duì)缺血性再灌注腦損傷的治療作用研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

9 楊懿;長(zhǎng)效GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的真核表達(dá)與生物活性鑒定[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

10 米夢(mèng)丹;透明顫菌血紅蛋白作為可視化標(biāo)簽在蛋白純化過程中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2016年

本文編號(hào)：831675