本文關(guān)鍵詞：共培養(yǎng)條件下脂肪干細(xì)胞成骨能力的改變

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【摘要】：目的以體外培養(yǎng)的經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(i ASCs)為研究對象,觀察i ASCs分別與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(PDMSCs)共同培養(yǎng)時,i ASCs成骨能力的變化。初步探究體內(nèi)MSCs對骨祖細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。材料和方法1、ASCs提取無菌條件下吸取新鮮的人皮下吸脂術(shù)所得的脂肪組織20m L,PBS沖洗,向脂肪組織懸液中加入I型膠原酶進(jìn)行震蕩消化,通過貼壁法獲得原代ASCs。DMEM/F-12培養(yǎng)液中原代培養(yǎng)7天,每3天換液一次,融合度達(dá)到70%-80%時傳代,應(yīng)用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,計數(shù)。2、cck-8檢測ASCs、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs在0-7天時的增殖曲線。3、實驗分組直接共培養(yǎng)組:取生長良好的第3代ASCs,于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中進(jìn)行7天誘導(dǎo)(i ASCs)。經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后,調(diào)整i ASCs密度至2×104/ml。將BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs,0.25%胰酶消化,調(diào)整各MSCs密度至1×104/ml。將100μL i ASCs分別與100μL的BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs混合加入96孔板,設(shè)實驗組,即為d-BMSCs組、d-UC-MSCs組和d-PDMSCs組,每組設(shè)6復(fù)孔。對照組為3×103個i ASCs單獨(dú)接種于96孔板,所設(shè)復(fù)孔數(shù)如實驗組。在不同的時間間期,檢測各組細(xì)胞磷酸酶活性和濃度。另設(shè)上述四組細(xì)胞,每組6孔,檢測不同時間間期各組細(xì)胞礦化基質(zhì)形成情況。所有細(xì)胞在24h后更換為礦化培養(yǎng)液。間接共培養(yǎng)組:生長良好的i ASCs經(jīng)消化后,細(xì)胞密度如上組。將100μL i ASCs含細(xì)胞2×103個加入96孔板中,分別用BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs的條件培養(yǎng)液培養(yǎng),設(shè)為實驗組,即為ind-BMSCs組、ind-UC-MSCs組和ind-PDMSCs組,24h后各組更換為相對應(yīng)的條件培養(yǎng)液。對照組為2×103個i ASCs培養(yǎng)于96孔板,為ind-i ASCs。上述四組細(xì)胞,每組6孔,檢測各組細(xì)胞磷酸酶活性和濃度。另設(shè)上述四組細(xì)胞,每組6孔,檢測不同時間間期各組細(xì)胞礦化基質(zhì)形成情況。4、檢測分析將上述96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),分別于第3,5,7,10,12,14天的同一時間點,每組取6孔,利用堿性磷酸酶試劑盒操作要求測定四組細(xì)胞光密度(OD)值,計數(shù)其堿性磷酸酶濃度和活性。分別于第7,10,12,14天的同一時間點,每組取6孔,利用茜素紅進(jìn)行染色。同時利用茜素紅染料可溶于氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride,CPC)溶液重新析出的特點,定量分析礦化基質(zhì)形成情況。實驗所得數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),以P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1、對于提取的ASCs,細(xì)胞具有類似成纖維細(xì)胞的形態(tài),具有典型的MSCs相關(guān)表面分子,同時具有向中胚層組織分化的潛能。BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs與ASCs具有相似的形態(tài)。通過繪制增殖曲線可知,增值能力UC-MSCsPDMSCsASCsBMSCs。2、ALP表達(dá)情況,不同組織來源的MSCs表現(xiàn)有差別。在直接共培養(yǎng)時,BMSCs促進(jìn)i ASCs表達(dá)ALP的能力最強(qiáng),其表達(dá)水平和活性均為最高,顯著高于其他兩種MSCs。UC-MSCs組和PDMSCs組表現(xiàn)相近。在間接共培養(yǎng)時,UC-MSCs和PDMSCs條件培養(yǎng)液促進(jìn)i ASCs表達(dá)ALP的能力強(qiáng)于BMSCs。3、礦化基質(zhì)形成情況,不同組織來源的MSCs同樣表現(xiàn)不同。共培養(yǎng)時各實驗組均高于對照組。在直接共培養(yǎng)時,PDMSCs組在各時間點礦化基質(zhì)形成最多,UC-MSCs組礦化基質(zhì)形成多于BMSCs組,但無統(tǒng)計學(xué)差異。在間接共培養(yǎng)組中,UC-MSCs條件培養(yǎng)液組礦化基質(zhì)形成多于BMSCs和PDMSCs條件培養(yǎng)液組,PDMSCs條件培養(yǎng)液組多于BMSCs條件培養(yǎng)液組。結(jié)論1、采用膠原酶消化法獲得的皮下脂肪來源的ASCs具有MSCs的特征。2、皮下脂肪來源的ASCs具有與BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs相似的細(xì)胞形態(tài),生長方式和增殖特性。3、ASCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)7天后獲得的i ASCs具有與骨祖細(xì)胞(成骨細(xì)胞前體)相似的特征,可為骨組織工程研究提供充足的細(xì)胞來源。4、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs均可促進(jìn)i ASCs向成骨細(xì)胞分化。又有各自不同的特點:BMSCs可促進(jìn)并維持i ASCs高表達(dá)ALP,使i ASCs處于成骨早期階段;UC-MSCs和PDMSCs在促進(jìn)ALP表達(dá)方面能力弱于BMSCs,但UC-MSCs和PDMSCs可加快i ASCs向成骨細(xì)胞分化的速度,并可促進(jìn)i ASCs分泌細(xì)胞外基質(zhì)。5、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs通過直接或間接接觸均可調(diào)節(jié)i ASCs向成骨細(xì)胞分化,但其中直接接觸調(diào)節(jié)起主要作用,直接接觸時所形成的ALP和礦化基質(zhì)多于間接接觸時所形成的量。6、無論是否接觸,共培養(yǎng)狀態(tài)下促進(jìn)i ASCs向成骨細(xì)胞分化的能力均比單獨(dú)培養(yǎng)強(qiáng)。MSCs在調(diào)控骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中起重要作用。
【關(guān)鍵詞】：脂肪干細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨共培養(yǎng)條件 培養(yǎng)液分化
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略語11-12
• 前言12-14
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性比較14-25
• 1.1 對象和方法14-18
• 1.1.1 研究對象14
• 1.1.2 儀器設(shè)備14-15
• 1.1.3 試劑及溶液配置15-16
• 1.1.4 流程圖16
• 1.1.5 脂肪干細(xì)胞提取與培養(yǎng)16-17
• 1.1.6 脂肪干細(xì)胞鑒定17
• 1.1.7 四種間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性比較17-18
• 1.1.8 數(shù)據(jù)分析18
• 1.2 結(jié)果18-22
• 1.2.1 脂肪干細(xì)胞的形態(tài)、表型18-19
• 1.2.2 成骨能力19-20
• 1.2.3 成脂能力20
• 1.2.4 四種間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較20-21
• 1.2.5 四種間充質(zhì)干細(xì)胞增值能力比較21-22
• 1.3 討論22-24
• 1.4 小結(jié)24-25
• 二、共培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成骨能力的改變25-48
• 2.1 對象和方法25-29
• 2.1.1 儀器設(shè)備25
• 2.1.2 實驗試劑及溶液配置25-26
• 2.1.3 流程圖26
• 2.1.4 制備條件培養(yǎng)基26-27
• 2.1.5 實驗分組27-28
• 2.1.6 堿性磷酸酶活性檢測28-29
• 2.1.7 礦化基質(zhì)形成檢測29
• 2.1.8 統(tǒng)計分析29
• 2.2 結(jié)果29-39
• 2.2.1 ASCs成骨誘導(dǎo)29-30
• 2.2.2 礦化培養(yǎng)液對三種未分化MSCs的影響30-31
• 2.2.3 細(xì)胞比例31-32
• 2.2.4 堿性磷酸酶比較32-36
• 2.2.5 定量分析礦化基質(zhì)形成36-39
• 2.3 討論39-48
• 2.3.1 MSCs在骨組織工程中的應(yīng)用39-40
• 2.3.2 共培養(yǎng)在骨組織工程中的應(yīng)用40-41
• 2.3.3 誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞特征41-42
• 2.3.4 不同共培養(yǎng)體系對ALP表達(dá)的影響42-43
• 2.3.5 不同共培養(yǎng)體系對礦化基質(zhì)形成的影響43-44
• 2.3.6 關(guān)于實驗組和對照組設(shè)置44-45
• 2.3.7 UC-MSCs和PDMSCs的成骨能力45
• 2.3.8 不同調(diào)節(jié)方式對iASCs成骨能力的影響45-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-57
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明57-58
• 綜述 脂肪干細(xì)胞用于組織再生的潛力58-71
• 綜述參考文獻(xiàn)63-71
• 致謝71-72
• 個人簡歷72

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本文編號：831155