本文關(guān)鍵詞：T細(xì)胞銜接活化因子-綠色熒光蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在Jurkat細(xì)胞的定位

  更多相關(guān)文章： LAT 綠色熒光蛋白 融合蛋白 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) T淋巴細(xì)胞

【摘要】：目的:構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)與T細(xì)胞銜接活化因子(Linker for activated of T cells,LAT)融合蛋白的真核表達(dá)載體,觀測(cè)LAT-EGFP在Jurkat細(xì)胞中的定位表達(dá)。方法:利用RT-PCR技術(shù)提取并擴(kuò)增LAT除去終止密碼子外的全部序列,克隆到真核表達(dá)載體PEGFP-N3,酶切鑒定并測(cè)序。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到Jurkat細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),熒光共聚焦顯微鏡觀察LAT-EGFP在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)及細(xì)胞定位。提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總RNA,通過RT-PCR的方法檢測(cè)LAT-EGFP在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。利用Western blot法進(jìn)一步鑒定融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果:重組載體經(jīng)酶切鑒定,切出片段長(zhǎng)度在750 bp左右與插入序列長(zhǎng)度相符,并進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序鑒定證實(shí)連接完全正確。共聚焦顯微鏡觀察表達(dá)的LAT-EGFP融合蛋白定位在細(xì)胞膜上,并呈點(diǎn)簇狀聚集狀態(tài)。RT-PCR擴(kuò)增證實(shí)了LAT和EGFP的融合蛋白在Jurkat細(xì)胞中在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),Western blot分析進(jìn)一步證明了LAT和EGFP融合蛋白構(gòu)建成功,并在蛋白水平上有明顯的融合表達(dá)。結(jié)論:成功構(gòu)建真核表達(dá)載體LAT-EGFP,且融合蛋白LAT-EGFP與野生型LAT在Jurkat細(xì)胞中的定位一致,具有功能表達(dá)效應(yīng),這為后續(xù)準(zhǔn)確研究具有棕櫚�；稽c(diǎn)的跨膜接頭蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用提供了一種良好的研究載體和方法。
【作者單位】： 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室;
【關(guān)鍵詞】： LAT 綠色熒光蛋白 融合蛋白 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) T淋巴細(xì)胞
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81273206)
【分類號(hào)】：R392.12
【正文快照】： LAT(Linker for activated T cells)最初是從活化的Jurkat T細(xì)胞膜成分中提取出來的,其表達(dá)具有造血細(xì)胞特異性,但僅限于T細(xì)胞、NK細(xì)胞和肥大細(xì)胞[1,2]。B細(xì)胞和單核細(xì)胞則不表達(dá)[3]。LAT在TCR信號(hào)傳遞的過程中起了重要的作用,是一個(gè)重要的接頭蛋白,在LAT缺陷的細(xì)胞中,TCR信號(hào)

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8 陳U

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