本文關(guān)鍵詞：腺苷A1和A2A受體在酒精性肝纖維化大鼠HSC模型中的作用及兩者間的相互作用研究

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【摘要】：長期酗酒是引起酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)最主要的原因,而酒精性肝纖維化(alcoholic liver fibrosis, ALF)是ALD進(jìn)展為酒精性肝硬化的中間階段和必經(jīng)病理過程。在酒精性肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中,乙醇可通過其中間活性代謝產(chǎn)物乙醛激活肝星狀細(xì)胞O(epatic stellate cell, HSC)。本課題組前期研究證實(shí)采用200 gM的乙醛體外刺激HSC細(xì)胞48h能成功建立大鼠酒精性肝纖維化HSC細(xì)胞模型。腺苷是一種內(nèi)源性嘌呤核苷酸,廣泛分布于機(jī)體內(nèi),且大多通過作用于細(xì)胞膜上的腺苷受體(adenosine receptors, ARs)來發(fā)揮相應(yīng)的生理作用。ARs屬G-蛋白偶聯(lián)受體超家族,可分為4種亞型,即A1R、A2AR、A2BR和A3R。其中A1受體和A2a受體為高表達(dá)受體,也是4種ARs中最主要的2種亞型。近年來隨著對(duì)A1R與A2AR選擇性激動(dòng)劑和拮抗劑的開發(fā),人們對(duì)兩者作用的多樣性研究越來越深入。然而,A1R與A2AR在酒精性肝纖維化HSC中的作用及兩者間的相互作用研究尚不清楚。為此,本研究選用離體HSC細(xì)胞為研究對(duì)象,采用200 μM的乙醛體外刺激HSC細(xì)胞48h來模擬大鼠酒精性肝纖維化HSC細(xì)胞模型,在模型基礎(chǔ)上分別過表達(dá)A1R與A2AR,在課題前期研究成果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討A1R與A2AR在酒精性肝纖維化中發(fā)揮的作用及兩者間的相互作用。目的：通過構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pEGFP-C2-A1R和pEGFP-C2-A2AR,分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞,建立A1R與A2AR在HS C細(xì)胞中的過表達(dá)模型,觀察A1R與A2AR的mRNA及其蛋白在HSC細(xì)胞中的表達(dá)。采用MTT和細(xì)胞周期測(cè)定實(shí)驗(yàn)同時(shí)監(jiān)測(cè)相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平,檢測(cè)A1R與A2AR分別過表達(dá)對(duì)大鼠酒精性肝纖維化HSC細(xì)胞活化增殖的影響,并通過免疫共沉淀技術(shù)聯(lián)合Western Blot方法來研究A1R與A2AR在酒精性肝纖維化HSC細(xì)胞中兩者間的相互作用。方法：從大鼠腦組織中提取目的基因A1R與A2AR,再用HindIII. KpnI對(duì)其分別進(jìn)行雙酶切,并同時(shí)雙酶切載體pEGFP-C2.酶切產(chǎn)物按常規(guī)連接方法進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5a,構(gòu)建pEGFP-C2-A 1 R與pEGFP-C2-A2AR真核表達(dá)質(zhì)粒。將成功構(gòu)建的pEGFP-C2-A 1 R與pEGFP-C2-A2AR重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定、測(cè)序后以脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞,于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá),運(yùn)用RT-PCR及Western Blot分別檢測(cè)A1R與A2AR的mRNA及蛋白的表達(dá)情況,以鑒定過表達(dá)模型是否建立成功。隨后參照課題組前期研究成果采用200μM的乙醛體外刺激HSC細(xì)胞48h來建立大鼠酒精性肝纖維化HSC細(xì)胞模型,RT-PCR及Western Blot法檢測(cè)A1R與A2AR分別上調(diào)后,目的基因、α-SMA.Collagen Ⅰ和Cyclin-D1的表達(dá)變化,同時(shí)采用MTT和細(xì)胞周期測(cè)定實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)HSC細(xì)胞活化增殖情況。pEGFP-C2-A1R與pEGFP-C2-A2AR真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HSC細(xì)胞后,利用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)A1R與A2AR蛋白間的相互作用。結(jié)果：1.成功構(gòu)建過表達(dá)模型：經(jīng)雙酶切鑒定可見目的條帶,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后可于熒光倒置顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。RT-PCR及Western Blot法可分別檢測(cè)出A1R和A2AR的mRNA及蛋白表達(dá)升高。2.A1R和A2AR分別過表達(dá)后對(duì)HSC細(xì)胞活化增殖的影響：在200 μM的乙醛體外刺激HSC細(xì)胞48h的情況下,發(fā)現(xiàn)A1R和A2AR分別過表達(dá)后,目的基因、α-SMA、Collagen I和Cyclin-D1的表達(dá)明顯上調(diào)。MTT結(jié)果表明模型組經(jīng)200μM乙醛作用48h后能明顯促進(jìn)HSC細(xì)胞增殖,過表達(dá)組的促進(jìn)作用更明顯。同時(shí)細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果顯示,模型組經(jīng)200μM乙醛作用48h后使分布在S期的細(xì)胞比例增多,G0/G1期的細(xì)胞比例減少。過表達(dá)組較模型組相比其分布在S期的細(xì)胞比例顯著增多,G0/G1期的細(xì)胞比例顯著減少。這提示A1R和A2AR分別過表達(dá)后能促進(jìn)HSC細(xì)胞的活化增殖。3. A1R與A2AR蛋白間的相互作用：利用免疫共沉淀技術(shù)聯(lián)合Western Blot方法,同時(shí)選用最后一次的洗滌上清作為陰性對(duì)照以消除非特異性蛋白及殘留的待測(cè)目的蛋白的干擾。Western Blot結(jié)果表明,免疫沉淀復(fù)合物中能檢測(cè)到相應(yīng)的目的蛋白,且免疫印跡中出現(xiàn)的條帶與HSC細(xì)胞總蛋白中的條帶位置一致而陰性對(duì)照組未檢測(cè)出條帶,表明A1R蛋白能夠與A2AR蛋白通過相互結(jié)合來發(fā)揮作用。結(jié)論：A1R和A2AR對(duì)酒精性肝纖維化大鼠HSC的活化增殖具有促進(jìn)作用,免疫共沉淀證實(shí)兩者間存在相互作用。
【關(guān)鍵詞】：酒精性肝纖維化 腺苷受體 重組質(zhì)粒 肝星狀細(xì)胞 活化增殖 免疫共沉淀
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.2;R-332
【目錄】：

• 英文縮略詞5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 1 前言14-15
• 2 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 3 實(shí)驗(yàn)方法17-30
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-41
• 5 討論41-44
• 6 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 附錄49-51
• 致謝51-52
• 綜述52-63
• 參考文獻(xiàn)59-63

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本文編號(hào)：827313