本文關(guān)鍵詞：p53基因敲除對豬成纖維細(xì)胞自噬影響的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：[目的]自噬是細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏、毒性壓力等條件下蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)降解過程,對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),促進(jìn)氨基酸等物質(zhì)的循環(huán)再利用具有重要意義。p53基因參與細(xì)胞凋亡、增殖、衰老、代謝的調(diào)節(jié),在噬調(diào)節(jié)中也扮演重要角色。p53基因能被不同壓力激活或抑制,從而抑制或促進(jìn)自噬發(fā)生后增加或減少細(xì)胞存活。課題組前期成功構(gòu)建p53基因敲除的豬成纖維細(xì)胞模型,本研究通過Ebss溶液饑餓誘導(dǎo)p53基因不同表型成纖維細(xì)胞自噬,研究p53基因?qū)ψ允傻挠绊?并通過RT-qPCR檢測和初步篩選p53調(diào)控自噬的相關(guān)基因,為進(jìn)一步研究p53調(diào)節(jié)自噬的具體分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。[方法](1)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；(2)應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性；(3) Western blot檢測蛋白水平變化；(4)細(xì)胞免疫熒光檢測自噬蛋白變化；(5)電子透射顯微鏡觀察細(xì)胞自噬體；(6) RT-qPCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)mRNA水平的變化。[結(jié)果](1)p53基因敲除對豬成纖維細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),與p53-wt PEFs相比,p53-/- PEFs發(fā)生明顯形態(tài)學(xué)改變,細(xì)胞胞體較小,界限不清,排列不規(guī)則；MTT法分析細(xì)胞1-7天生長情況結(jié)果示,兩種細(xì)胞呈“S”型曲線生長,p53-/- PEFs的生長速度顯著快于p53-wt PEFs (p0.05,n=3)。(2) Ebss饑餓處理對p53不同表型豬成纖維細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響經(jīng)EBSS處理Oh、24h、48h后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,p53-wt PEFs較p53-/- PEFs對饑餓環(huán)境壓力較敏感,細(xì)胞形態(tài)改變嚴(yán)重,并出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡；MTT結(jié)果示, Ebss處理對p53-wt PEFs和p53-/-PEFs存活率影響的比較,24h為87.71%vs 95.11%(p0.05,n=3),48h為44.55% vs 63.85%(p0.01,n=3)。(3) Ebss饑餓處理對p53不同表型豬成纖維細(xì)胞自噬的影響Western blot檢測自噬標(biāo)記蛋白LC3B的表達(dá),經(jīng)Ebss 4h處理后,, p53-wt PEFs和p53-/- PEFs的LC3B-Ⅱ/β-actin表達(dá)升高,前者升高1.65倍,后者升高2.1倍,兩者相比有顯著性差異(p0.001,n=3)；另通過細(xì)胞免疫熒光檢測同樣處理下LC3B的表達(dá)情況,LC3B在p53-/- PEFs中的表達(dá)較p53-wt PEFs中明顯升高；透射顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬形成情況,p53-wt PEFs中自噬體形成較少且處于自噬早期階段,而p53-/- PEFs中大量自噬體形成且處于自噬晚期階段。(4) Ebss饑餓處理對p53不同表型豬成纖維細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響成纖維細(xì)胞敲除p53基因后,以p53-wt PEFs為對照,mRNA表達(dá)差異1.5倍的基因有：Atg2a、Atg4a、Atg5、Atg13、DAPK、Vps15;當(dāng)Ebss饑餓處理4h后,p53-wt PEFs中自噬相關(guān)基因mRNA水平大都呈表達(dá)改變不明顯；而在p53-/- PEFs中自噬相關(guān)基因的mRNA水平呈上升趨勢,其中上升倍數(shù)2.5倍的有Atg2a、Atg4a、Atg9a、Atg9b、Epg5、Vps15、DAPK、RAB1A;通過分析比較初步篩選出Atg9a、Atg9b、Epg5、RAB1A為p53調(diào)控自噬的潛在基因。[結(jié)論](1)p53基因在豬成纖維細(xì)胞的形態(tài)維持和細(xì)胞增殖中起重要作用。(2)p53基因敲除促進(jìn)豬成纖維細(xì)胞的增殖速率及對饑餓壓力的耐受力。(3)p53基因敲除后促進(jìn)饑餓誘導(dǎo)的豬成纖維細(xì)胞自噬。(4)初步篩選出p53調(diào)控豬成纖維細(xì)胞自噬的相關(guān)基因Atg9b、Epg5、 RAB1A),為進(jìn)一步研究具體分子機(jī)制奠定前期基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：p53 自噬 饑餓 增殖 LC3
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-16
• 技術(shù)路線16-17
• 材料與方法17-31
• 結(jié)果31-41
• 討論41-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 綜述51-59
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果59-60
• 致謝60

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6 張誠s，

本文編號(hào)：804808