本文關鍵詞：產氣莢膜梭菌epsilon毒素突變體疫苗的相關基礎研究

  更多相關文章： 產氣莢膜梭菌 epsilon毒素 定點突變 重組疫苗 腸毒血癥

【摘要】：產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)廣泛存在于自然界和動物的腸道中,是一種重要的人獸共患傳染病的病原體之一。該菌可產生多種外毒素,根據其中的四種主要外毒素α、β、ε以及ι可將產氣莢膜梭菌分為五個型別,分別是A、B、C、D和E型。在四種主要的外毒素中,由B和D型產氣莢膜梭菌產生的ε毒素是一種劇烈的致病因子,能夠導致羔羊和犢牛的腸道致死性疾病以及綿羊和山羊等動物的壞死性腸炎或者腸毒血癥。由于ε毒素所導致動物的以上疾病具有發(fā)病急、死亡快及病程短等特點,使抗生素的治療沒有顯著的意義,給世界各地的畜牧業(yè)造成巨大的經濟損失。預防動物壞死性腸炎和腸毒血癥最有效的方法是注射疫苗,和傳統(tǒng)的ε毒素的脫毒疫苗相比,重組ε毒素的減毒疫苗的研究正在成為熱點。本研究首先通過結構變化和定點突變的方法篩選減毒或無毒的ETX突變體蛋白,具體方法是以本實驗室留存的分別帶有pET-His-etx和pTIG-etx載體的菌株為基礎,根據QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit操作說明書設計多對定點突變引物,通過PCR擴增技術分別對兩個載體進行多位點的定點突變,將PCR產物用DpnI酶(可專一消化帶有甲基化的DNA)消化后進行測序驗證,將測序無誤的載體轉化到到大腸桿菌感受態(tài)細胞Escherichia coli BL21(DE3)pLysS中。挑取單克隆菌落于5 m L的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng),將擴增后的菌液保存在冰箱,同時進行測序鑒定,鑒定正確的菌體按照1:100的比例轉接到500 mL LB培養(yǎng)基中,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至A600值0.6-0.8時加入IPTG誘導劑,使其終濃度為1 mM,然后置于16℃的搖床中過夜誘導。將誘導后的菌液8000 r/min離心15 min后去上清,沉淀用PBS重懸后再次離心去上清,沉淀用100 mL蛋白純化A液重懸后,超聲破碎菌體。破碎的懸液在8000 r/min的轉速下離心15 min收集上清,隨后上清用0.45μm孔徑大小的濾膜過濾后備用,用NaOH溶液清洗純化儀,然后使蛋白純化A液進入純化儀,緊接著進過濾后的上清,再進一次蛋白純化A液后進蛋白純化B液,使用Ni2+柱對誘導后的蛋白進行純化,SDS-PAGE實驗對純化后的蛋白純度鑒定,western-blot實驗對蛋白的抗原性進行鑒定。將超濾濃縮后的各突變體蛋白進行細胞毒性和動物毒力實驗,分別用MTS法和改良寇式法計算細胞的CT50和小鼠的LD50以此驗證各突變體蛋白的減毒效果。將減毒效果比較明顯的epsilon毒素各突變體蛋白進行后續(xù)系列實驗,以此闡明突變體蛋白的減毒機制。首先選取對etx敏感的mdck細胞進行細胞結合實驗,將不同濃度的各突變體蛋白和mdck細胞孵育后,用4%的多聚甲醛固定15min,用5%的bsa封閉后和anti-his單克隆抗體孵育,最后和hrp熒光基團標記的羊抗鼠igg孵育。分別用多功能讀板儀和激光共聚焦顯微鏡對mdck細胞表面的各突變體蛋白進行檢測。隨后對突變體蛋白在mdck細胞上的七聚體形成能力進行檢測,將突變體蛋白和mdck細胞孵育后高溫裂解細胞,用裂解后的細胞液懸液進行western-blot實驗。然后使用鈣離子探針檢測突變體蛋白的成孔能力,將鈣離子探針和mdck細胞孵育后清洗干凈,用含有cacl2的hbss緩沖液將突變體蛋白稀釋到不同的濃度,將稀釋好的緩沖液和mdck細胞孵育,并實時在多功能讀板儀中連續(xù)讀取熒光值,以熒光值的變化來反映突變體蛋白的成孔能力。最后采用圓二色譜實驗對各突變體蛋白的二級結構進行檢測,以pbs作為背景,測定蛋白在190-260nm處的紫外吸收。選取四種突變體蛋白中減毒幅度最大的retxy196e-c蛋白作為抗原進行小鼠的免疫實驗。首先對抗原的免疫劑量和免疫途徑進行優(yōu)化,將balb/c小鼠隨機分為7組,每組20只,設置三個抗原免疫劑量和兩個免疫途徑,7個實驗組分別是5μg皮下免疫組,5μg腹腔免疫組,10μg皮下免疫組,10μg腹腔免疫組,15μg皮下免疫組,15μg腹腔免疫組和1個pbs免疫組。小鼠共免疫三次,每兩天測量一次小鼠體重,每次免疫一周后尾靜脈采血進行elisa檢測小鼠血清抗體效價,在第三次免疫一周后取部分小鼠進行天然毒素的攻毒實驗,蛋白免疫組的小鼠設置三個劑量,分別是100×ld50,500×ld50和1000×ld50天然毒素,而pbs免疫組的小鼠設置一個10×ld50天然毒素攻毒劑量。另一部分小鼠取脾臟和全血,小鼠的脾臟經過裂解破碎后對其中t淋巴細胞進行染色,用流式細胞儀檢測小鼠t淋巴細胞中兩種細胞因子il-4和ifn-γ的比例。小鼠的全血經離心后取上清和等體積的重組天然毒素retx在37℃孵育30min后加入到mdck細胞或腹腔注射到正常小鼠體內,觀察免疫后小鼠血清的體外中和能力。為了驗證由突變體蛋白retxy196e-c刺激小鼠免疫系統(tǒng)產生的抗體與天然毒素retx和retxy196e-c之間的親和力差別,將兩種蛋白包被在酶聯板中,分別和小鼠的血清或單克隆抗體孵育,用不同濃度的nh4scn洗脫的方式進行親和力指數的測定。通過本研究方法,成功構建和表達了四種etx突變體蛋白retx、retx-c、retxy196e以及retxy196e-c,并通過實驗驗證了c-末端和196位氨基酸突變都能減弱epsilon毒素的毒性且兩種因素之間存在協(xié)同作用,其中c-末端主要通過影響epsilon毒素與靶細胞的結合繼而影響了成孔和七聚體的形成來減弱epsilon毒素的毒性,而196位氨基酸突變只是微弱的影響了成孔和七聚體的形成。動物實驗和活細胞實驗結果顯示,突變體蛋白rETX-C和rETXY196E的小鼠LD50值為110,000,rETX的小鼠LD50值為7910,而突變體蛋白rETXY196E-C的小鼠LD50值為1770,000。說明只突變Y196位氨基酸或只加入C-末端時,其對細胞和動物的毒性減弱幅度相似,Y196為氨基酸突變一定通過某種機制影響了epsilon毒素的毒性,但是具體是通過哪種機制還沒有完全闡明。動物免疫實驗結果顯示,減毒幅度最大的突變體蛋白rETXY196E-C能夠較好的刺激小鼠免疫系統(tǒng),使其產生較多且同時具有體內體外中和活性的抗體。在6個實驗組中,15μg皮下免疫組的小鼠80%能夠抵抗1000×LD50天然毒素的攻擊,皮下免疫組的小鼠能夠抵抗500×LD50天然毒素的攻擊,而腹腔免疫組的小鼠只能抵抗100×LD50天然毒素的攻擊。病理實驗結果顯示,PBS免疫組的小鼠在經過1000×LD50天然毒素的攻擊后,小鼠的腦部出現了大量的空泡狀壞死,小鼠的腎出現了嚴重的出血壞死。而15μg劑量組皮下免疫方式的小鼠在遭受1000×LD50天然毒素的攻擊后,其腎臟和腦部的病變壞死得到了明顯的改善。以上結果表明,免疫后的小鼠能夠明顯減弱天然毒素對其敏感器官的損傷。說明皮下免疫方式優(yōu)于腹腔免疫,15μg劑量優(yōu)于其他兩個劑量。抗原抗體親和力實驗結果顯示,由蛋白rETXY196E-C刺激小鼠產生的抗體與rETX和rETXY196E-C之間的親和力沒有顯著差別。因此,通過這種結構變化和定點突變的方式篩選epsilon毒素候選疫苗是可行的,同時重組蛋白rETXY196E-C具有較好的免疫原性和安全性,可作為ETX的候選疫苗研究,具有廣闊的前景。
【關鍵詞】：產氣莢膜梭菌 epsilon毒素 定點突變 重組疫苗 腸毒血癥
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 第一部分 產氣莢膜梭菌epsilon毒素減毒突變體的構建及減毒機制的研究14-35
• 1 材料與方法15-21
• 1.1 材料和試劑15
• 1.2 主要儀器15
• 1.3 細菌的培養(yǎng)，質粒的提取15
• 1.4 突變引物的設計15-16
• 1.5 突變基因引入載體16-17
• 1.6 突變質粒的轉化、鑒定17-18
• 1.7 突變體蛋白的表達、純化18
• 1.8 各突變體蛋白的濃縮、定量18-19
• 1.9 突變體蛋白的動物毒力實驗19
• 1.10 減毒突變體蛋白的免疫實驗19
• 1.11 突變體蛋白的細胞毒性實驗19
• 1.12 突變體蛋白的七聚體形成實驗19
• 1.13 突變體蛋白和MDCK細胞的結合能力實驗19-20
• 1.14 減毒突變體蛋白的成孔能力實驗20
• 1.15 圓二色譜實驗20-21
• 2 結果21-33
• 2.1 PCR鑒定結果21-22
• 2.2 定點突變后基因測序結果比對22-23
• 2.3 蛋白表達與純化23-27
• 2.4 蛋白定量27-28
• 2.5 突變體蛋白的動物毒性實驗28
• 2.6 四種突變體蛋白的western-blot實驗28-29
• 2.7 減毒重組蛋白的細胞毒性實驗29
• 2.8 四種減毒重組蛋白的七聚體形成實驗29-30
• 2.9 減毒重組蛋白的細胞結合實驗30-31
• 2.10 重組蛋白的成孔能力比較31-32
• 2.11 圓二色譜實驗32-33
• 3 討論33-35
• 第二部分 重組減毒突變體蛋白rETX~(Y196E)-C的小鼠免疫效果評價35-48
• 1 材料與方法36-40
• 1.1 材料36
• 1.2 突變體蛋白rETX~(Y196E)-C熱穩(wěn)定性實驗36-37
• 1.3 小鼠的領取和培養(yǎng)37
• 1.4 減毒蛋白和佐劑混合及動物免疫37
• 1.5 免疫后小鼠的攻毒實驗37
• 1.6 小鼠血清的抗體效價測定及抗原抗體的親和力測定37-38
• 1.7 免疫后小鼠血清的體外中和實驗38
• 1.8 病理損傷實驗38
• 1.9 免疫小鼠體內的細胞因子檢測38-40
• 2 結果40-46
• 2.1 蛋白的熱穩(wěn)定性實驗40
• 2.2 免疫過程中小鼠體重變化40-41
• 2.3 免疫后小鼠的攻毒實驗41-42
• 2.4 免疫后小鼠血清的抗體效價42-43
• 2.5 抗原抗體親和力實驗43
• 2.6 體外中和實驗43-44
• 2.7 病理損傷實驗44-45
• 2.8 流式細胞實驗45-46
• 3 討論46-48
• 結論48-49
• 參考文獻49-52
• 附錄52-54
• 個人簡歷54-55
• 致謝55

【相似文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 朱恒奇,徐秀英,陳琳,黃培堂;重組人組織型纖溶酶原激活劑及其突變體的溶血栓研究[J];中國生化藥物雜志;2003年06期

2 周紅霞;周梅仙;吳潔;胡卓逸;劉景晶;;人源血管內皮生長因子突變體的克隆、分離純化及活性研究[J];中國藥科大學學報;2006年03期

3 白常樂;;鼠疫桿菌的誘導維生素依賴突變體的發(fā)生率[J];地方病譯叢;1979年03期

4 任啟生;;IL-6的結構與功能分析[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);1991年03期

5 吳松泉，劉麗，歐陽應斌，，黃培堂，梁植權;重組人腫瘤壞死因子突變體的構建和表達[J];溫州醫(yī)學院學報;1996年03期

6 王瀟,沈心亮,應蓮芳,蘇彩霞,吳敏,鄭榮梁;基因重組人腫瘤壞死因子-α突變體的構建[J];微生物學免疫學進展;1999年02期

7 白應林,王瑋,陳玲愛,翁曼麗,馬志方;淀粉酶生產菌(Bacillus subtilis BF-7658)孢子形成突變體的分離和特性[J];遺傳學報;1977年04期

8 胡忠,彭麗萍,蔡永華;一個黃綠色的水稻細胞核突變體[J];遺傳學報;1981年03期

9 劉寶英,聶尚海,杜清友,丁紅梅,劉農樂,王會信;人胰島素樣生長因子1突變體的構建、表達及其鑒定[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;1999年02期

10 梁秋娟;張華莉;涂自智;肖獻忠;;熱休克轉錄因子1及其突變體的研究進展[J];國際病理科學與臨床雜志;2008年03期

中國重要會議論文全文數據庫 前10條

1 易小平;陳芳遠;盧升安;周開達;;空間環(huán)境誘發(fā)水稻突變體特異親和性研究[A];面向21世紀的科技進步與社會經濟發(fā)展（上冊）[C];1999年

2 戴新賓;張榮銑;許長成;匡廷云;;水稻葉綠素b減少突變體的光抑制特性研究[A];全國植物光合作用、光生物學及其相關的分子生物學學術研討會論文摘要匯編[C];2001年

3 金衛(wèi)華;曹軍衛(wèi);姚保利;雷銘;;細菌視紫紅質多突變體的構建及其功能研究[A];第二屆中國青年學者微生物遺傳學學術研討會論文集[C];2006年

4 胡天岑;王奎鋒;李連維;陳靜;蔣華良;沈旭;;SARS冠狀病毒3CL蛋白酶突變體的結構對其聚合-活性關系的提示[A];中國晶體學會第四屆全國會員代表大會暨學術會議學術論文摘要集[C];2008年

5 李鵬麗;王寧寧;;微型番茄黃葉突變體的獲得與鑒定[A];中國植物生理學會第十次會員代表大會暨全國學術年會論文摘要匯編[C];2009年

6 程備久;mail.hf.ah.cn);李展;mail.hf.ah.cn);朱蘇文;mail.hf.ah.cn);李純;mail.hf.ah.cn);李培金;mail.hf.ah.cn);謝傳曉;mail.hf.ah.cn);;玉米對生突變體的遺傳與分子標記研究[A];第八屆全國激光生物學學術會議暨《激光生物學》創(chuàng)刊十周年慶祝會會議指南及論文摘要[C];2002年

7 許曉明;張榮銑;;水稻葉綠素缺乏突變體的吸收光能分配特性[A];中國植物生理學會全國學術年會暨成立40周年慶祝大會學術論文摘要匯編[C];2003年

8 林植芳;彭長連;徐信蘭;林桂珠;張景六;;兩個新的水稻缺葉綠素b突變體光合作用的熱穩(wěn)定性[A];中國植物生理學會第九次全國會議論文摘要匯編[C];2004年

9 魏玉波;梁乃亭;布哈麗且木;;水稻永綠突變體及應用價值[A];中國科協(xié)2005年學術年會論文集——核科技、核應用、核經濟論壇[C];2005年

10 夏宗薌;鄔鍵;甘建華;黃仲賢;;細胞色素b_5的一系列突變體的晶體結構及其與性質、功能的關系[A];第九次全國生物物理大會學術會議論文摘要集[C];2002年

中國重要報紙全文數據庫 前3條

1 記者 張克;我科學家發(fā)現水稻衰老調控分子機制[N];科技日報;2014年

2 錢海豐 編譯;植物耐鹽基因的研究[N];中國高新技術產業(yè)導報;2002年

3 記者 馮衛(wèi)東;美發(fā)現能控制小鼠胖瘦的基因[N];科技日報;2007年

中國博士學位論文全文數據庫 前10條

1 李成;誘導超氧化物歧化酶錯誤折疊的因素及其分子機制[D];武漢大學;2012年

2 張子棟;透明顫菌血紅蛋白及其突變體蛋白對芳香族污染物清除作用的實驗研究[D];東北林業(yè)大學;2015年

3 Syed Noor Muhammad Shah;黃瓜品系9930誘導突變體的研究[D];西北農林科技大學;2015年

4 康樂群;家蠶新突變體4齡幼蟲致死基因的定位克隆及功能研究[D];江蘇科技大學;2015年

5 史貴霞;大豆子葉折疊突變體cco的轉錄組分析及相關基因的功能研究[D];南京農業(yè)大學;2014年

6 胡運高;直立重穗突變體的遺傳分析、候選基因克隆與育種利用[D];四川農業(yè)大學;2015年

7 TAREK MOHAMED AHMED SOLIMAN(羅大力);通過γ-射線輻射處理菊花外植體篩選花色和花型突變體[D];中國農業(yè)大學;2014年

8 王濵;斑馬魚造血突變體的大規(guī)模篩選以及髓系過氧化物酶缺陷突變體smu681的基因定位克隆與功能研究[D];南方醫(yī)科大學;2014年

9 劉逢舉;陸地棉極短纖維突變體的遺傳、精細定位與表達譜分析[D];南京農業(yè)大學;2010年

10 王旭;番茄rin突變體胎萌的生理機制及rin在胎萌中的作用[D];東北農業(yè)大學;2016年

中國碩士學位論文全文數據庫 前10條

1 李紅;采用分子動力學模擬探究VWF-A1突變體G561S的親和力變化機制[D];華南理工大學;2015年

2 谷慧英;芥菜開花整合子SOC1與開花抑制因子SVP、FLC蛋白相互作用[D];西南大學;2015年

3 蔣發(fā)明;斑馬魚消化器官突變體的遺傳篩選和Ubel蛋白的原核表達純化及抗體生產[D];西南大學;2015年

4 王帆;葉綠體體積和數目的改變對擬南芥抗逆性的影響[D];河北師范大學;2011年

5 丁正潔;擬南芥葉綠體J-蛋白突變體鑒定及功能初探[D];河北師范大學;2011年

6 朱玲;水稻長護穎突變體和條紋葉突變體的基因鑒定與qRT-PCR表達分析[D];四川農業(yè)大學;2015年

7 秦亞芝;一個水稻分蘗角度突變體的遺傳分析與精細定位[D];四川農業(yè)大學;2015年

8 任云;一個水稻小粒矮稈突變體的遺傳分析與基因定位[D];四川農業(yè)大學;2014年

9 李進;一份水稻葉尖枯萎突變體xynln的表型分析和基因定位[D];四川農業(yè)大學;2015年

10 陳華偉;一份輻射誘變玉米雄性不育突變體的遺傳鑒定[D];四川農業(yè)大學;2015年

本文編號：798205