本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌受體蛋白ArlS胞漿域的表達(dá)、純化及活性研究

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【摘要】：金黃色葡萄球菌是一種典型的革蘭氏陽性菌,它是人類主要的病原菌之一,可引起傷口的化膿感染,誘發(fā)內(nèi)臟器官感染,導(dǎo)致肺炎,心內(nèi)膜炎及膿毒血癥等一系列疾病,可以導(dǎo)致人免疫能力的降低甚至死亡。金黃色葡萄球菌的致病機(jī)制與其能分泌多種細(xì)胞外毒素及胞外酶密切相關(guān),當(dāng)細(xì)菌對寄主細(xì)胞造成感染后將會(huì)表達(dá)一系列的毒力因子,這些毒力因子的表達(dá)受多個(gè)基因組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。arl雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)直接或間接調(diào)控多種毒力因子的表達(dá),該系統(tǒng)中的組氨酸激酶蛋白ArlS可以感受胞外信號并將信號傳遞至胞內(nèi),引起反應(yīng)調(diào)控蛋白ArlR的磷酸化并開啟arl系統(tǒng)。因此,以ArlS蛋白以及arl雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)作為治療金黃色葡萄球菌感染的藥物靶點(diǎn),對于減輕或抑制金黃色葡萄球菌毒力因子的產(chǎn)生,達(dá)到控制金黃色葡萄球菌感染的目的具有重要意義。本文首先利用無限制克隆法擴(kuò)增目的基因,利用酶切酶連的方法構(gòu)建了pProEX-HTa-arls和pProEX-HTa-arlr重組質(zhì)粒,化學(xué)法轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將測序成功的重組質(zhì)�；D(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(RIL)中,對目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。其次,利用金屬離子螯合層析、離子交換層析以及凝膠過濾層析方法對目的蛋白進(jìn)行分離純化,純化后的ArlR蛋白純度可達(dá)98%,產(chǎn)量約為25 mg/L;純化后的ArlS蛋白純度可達(dá)90%,產(chǎn)量約為15 mg/L。利用圓二色譜檢測純化后的ArlR蛋白,結(jié)果顯示純化后的目的蛋白具有完整的二級結(jié)構(gòu)。利用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay方法測定ArlS蛋白的激酶活性,檢測結(jié)果顯示純化后的ArlS蛋白具有激酶活性。體外磷酸化結(jié)果顯示,ArlS蛋白自磷酸化后可以將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移,進(jìn)而磷酸化下游的反應(yīng)調(diào)控蛋白ArlR。最后,利用定點(diǎn)突變的方法,構(gòu)建了418位和420位氨基酸殘基突變的表達(dá)載體即pProEX-HTa-ArlS_(CAG418A)和pProEX-HTa-ArlS_(CAG420A)。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化后得到對應(yīng)的目的蛋白即ArlS_(CAG418A)和ArlS_(CAG420A),利用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay方法測定蛋白激酶活性,結(jié)果顯示ArlS_(CAG418A)和ArlS_(CAG420A)蛋白不具有激酶活性,證明了418位和420位氨基酸殘基在ArlS蛋白的自磷酸過程中起著關(guān)鍵作用。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 ArlS 蛋白純化 激酶活性
【學(xué)位授予單位】：大連工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.11
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-25
• 1.1 金黃色葡萄球菌的致病性及耐藥性10-11
• 1.1.1 金黃色葡萄球菌10
• 1.1.2 金黃色葡萄球菌的致病性10-11
• 1.1.3 金黃色葡萄球菌的耐藥性11
• 1.2 細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)11-14
• 1.2.1 細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)簡介11-12
• 1.2.2 金黃色葡萄球菌雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)12-14
• 1.3 ArlRS雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)14-18
• 1.4 實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡介18-23
• 1.4.1 表達(dá)載體的構(gòu)建18-19
• 1.4.2 蛋白純化及檢測技術(shù)介紹19-22
• 1.4.2.1 蛋白純化技術(shù)19-21
• 1.4.2.1.1 金屬離子螯合層析19-20
• 1.4.2.1.2 離子交換層析20-21
• 1.4.2.1.3 凝膠過濾層析21
• 1.4.2.2 蛋白檢測技術(shù)21-22
• 1.4.2.2.1 電泳技術(shù)21-22
• 1.4.2.2.2 圓二色譜22
• 1.4.3 定點(diǎn)突變22-23
• 1.5 本研究工作的內(nèi)容及意義23-25
• 第二章 ArlR及ArlS表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)25-31
• 2.1 引言25
• 2.2 材料與方法25-29
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-27
• 2.2.1.1 菌株與質(zhì)粒25
• 2.2.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液25-26
• 2.2.1.3 試劑及儀器26-27
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-29
• 2.2.2.1 ArlS_(CA)和ArlR表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)27-28
• 2.2.2.2 ArlS_(CA)和ArlR蛋白的表達(dá)28-29
• 2.3 結(jié)果與討論29-31
• 2.3.1 ArlS_(CA)和ArlR表達(dá)載體的構(gòu)建29-30
• 2.3.2 ArlS_(CA)和ArlR蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)30-31
• 第三章 蛋白的分離純化及活性檢測31-43
• 3.1 引言31
• 3.2 材料與方法31-37
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料31-34
• 3.2.1.1 培養(yǎng)基及緩沖液31-33
• 3.2.1.2 試劑及儀器33-34
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 3.2.2.1 金屬離子螯合層析技術(shù)純化蛋白34-35
• 3.2.2.2 離子交換層析技術(shù)純化ArlR蛋白35
• 3.2.2.3 凝膠過濾層析技術(shù)純化蛋白35
• 3.2.2.4 圓二色譜檢測ArlR蛋白二級結(jié)構(gòu)35-36
• 3.2.2.5 ArlS_(CA)蛋白激酶活性的檢測36-37
• 3.2.2.6 ArlS蛋白體外磷酸化ArlR蛋白37
• 3.3 結(jié)果與討論37-43
• 3.3.1 ArlR蛋白的純化37-38
• 3.3.2 ArlR蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定38-39
• 3.3.3 ArlS_(CA)蛋白的純化及激酶活性的測定39-41
• 3.3.4 ArlS_(CA)蛋白激酶活性的研究41
• 3.3.5 ArlS_(CA)蛋白的體外磷酸化作用41-43
• 第四章 ArlS蛋白定點(diǎn)突變菌株的構(gòu)建43-51
• 4.1 引言43-44
• 4.2 材料與方法44-47
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料44-45
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法45-47
• 4.2.2.1 構(gòu)建定點(diǎn)突變表達(dá)載體45-47
• 4.2.2.2 表達(dá)純化ArlS_(CA-G418A)和ArlS_(CA-G420A)蛋白47
• 4.2.2.3 ArlS_(CA-G418A)和ArlS_(CA-G420A)蛋白激酶活性的測定47
• 4.3 結(jié)果與討論47-51
• 4.3.1 ArlS_(CA)蛋白定點(diǎn)突變表達(dá)載體的構(gòu)建47-48
• 4.3.2 ArlS_(CA-G418A)和ArlS_(CA-G420A)蛋白的純化48-49
• 4.3.3 ArlS_(CA-G418A)和ArlS_(CA-G420A)蛋白激酶活性的測定49-51
• 第五章 總結(jié)與展望51-53
• 5.1 總結(jié)51
• 5.2 展望51-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況57-58
• 附錄58-63
• 附錄A ArlS堿基序列58-59
• 附錄B ArlR堿基序列59
• 附錄C DNA凝膠回收操作步驟59-60
• 附錄D PCR純化操作步驟60
• 附錄E 提取質(zhì)粒操作步驟60-61
• 附錄F SDS-PAGE操作方法61-62
• 附錄G pProEX-HTa載體質(zhì)粒圖譜和多克隆位點(diǎn)信息62-63
• 致謝63-64

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：793738