本文關(guān)鍵詞：人鼻病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B激活PERK-eIF2α信號通路引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制研究

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【摘要】：人類鼻病毒(Human rhinovirus, HRV)是普通感冒最重要的病原體。HRV除了可以引起上呼吸道感染,還可以造成嚴(yán)重的下呼吸道疾病,如細(xì)支氣管炎、肺炎、喘息性疾病等。此外,HRV還可與其他病毒和細(xì)菌發(fā)生共同感染而加重哮喘和慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)病情進(jìn)展。根據(jù)基因序列同源性分析,HRV可分為HRV-A、HRV-B口HRV-C 3組。超過90%的HRV-A和-B利用細(xì)胞間粘附分子-1 (Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)作為進(jìn)入細(xì)胞的受體,極少數(shù)約10個血清型通過低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)受體進(jìn)入細(xì)胞[3,41。HRV進(jìn)入人體后,主要在呼吸道上皮細(xì)胞及局部淋巴組織中增殖,造成被感染組織細(xì)胞病變以及炎性反應(yīng)。然而,HRV引發(fā)呼吸道疾病的具體致病機(jī)制還不十分清楚。HRV感染敏感細(xì)胞后,通過破壞上皮細(xì)胞屏障,尤其破壞了緊密連接,而引起血管滲漏和粘膜分泌增加。HRV感染鼻粘膜上皮細(xì)胞后,可降低zona occluden (ZO)-1、claudin-1和E-鈣粘素的mRNA和蛋白表達(dá)水平,損傷粘膜屏障。細(xì)胞滲透性的增加,上皮細(xì)胞屏障的破壞均有利于病毒及其誘導(dǎo)物的轉(zhuǎn)位,病毒等轉(zhuǎn)位后與暴露出的上皮基底細(xì)胞受體(如TLR和PRRs)結(jié)合誘導(dǎo)先天性免疫反應(yīng)。HRV通過對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的顯著影響,如細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化,干擾胞內(nèi)的Ca2+平衡,引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬[7-9],來調(diào)控自身的復(fù)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum, ER)廣泛存在于除哺乳動物成熟的紅細(xì)胞外的各種真核細(xì)胞中。承擔(dān)著細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊、修飾和運輸?shù)淖饔?此外,還是細(xì)胞內(nèi)Ca2+的重要儲存器,調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、Ca2+水平以及蛋白質(zhì)合成、折疊和運輸?shù)恼{(diào)節(jié)過程。細(xì)胞ER膜上存在三種調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的跨膜蛋白[11]：需肌醇蛋白1(Inositol Requiring enzyme 1, Irel)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase, PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor-6, ATF6)。正常情況下, GRP78(78KD Glucose Regulated Protein)結(jié)合三種跨膜蛋白的ER腔內(nèi)段而抑制其活性。病毒感染等可引起ER上Ca2+通道的改變,從而造成ER腔內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的改變；并影響蛋白質(zhì)合成、修飾和折疊,產(chǎn)生未折疊和錯誤折疊蛋白,過多的未折疊和錯誤折疊蛋白誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress, ERS)。在ERS反應(yīng)過程中,細(xì)胞通過未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolding protein response, UPR)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超載反應(yīng)(ER overlod response, EOR)來降低蛋白質(zhì)的合成,促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊,三種跨膜蛋白質(zhì)與GRP78發(fā)生解離,IRE1和PERK發(fā)生寡聚化及其自身磷酸化,刺激下游信號的激活。ATF6從ER轉(zhuǎn)位至高爾基體,先后被S1P與S2P蛋白酶切割,釋放出N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,產(chǎn)生活化型ATF6。同時,UPR引起GRP78等反應(yīng)性高表達(dá),激活ER相關(guān)的蛋白降解(ER assciated degradation, EARD)通路降解不正常蛋白,以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)損傷太過嚴(yán)重,超出了UPR的調(diào)控范圍,內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)持續(xù)紊亂無法及時恢復(fù),ERS則將促生存信號轉(zhuǎn)化促凋亡信號,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。多項研究表明ER與支氣管哮喘和COPD的病理發(fā)生密切相關(guān)[13,14],且通過ERS通路中的PERK調(diào)控NFK B而影響炎性反應(yīng)。研究顯示,多種小RNA病毒的非結(jié)構(gòu)2B蛋白可以在ER上形成膜通道,造成細(xì)胞損傷[15-18],包括增加細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的通透性和干擾胞內(nèi)Ca2+平衡。而由95個氨基酸組成的HRV的2B蛋白也具有兩個疏水區(qū),有研究發(fā)現(xiàn)HRV16 2B蛋白可定位表達(dá)于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,并對蛋白分泌運輸造成一定影響[19]。由此我們推測HRV的2B蛋白可能誘導(dǎo)ERS,并在HRV的致病中發(fā)揮一定的作用。因此我們針對HRV的2B蛋白對細(xì)胞ERS的誘導(dǎo)展開研究。為深入了解HRV的非結(jié)構(gòu)蛋白2B對細(xì)胞的影響,我們構(gòu)建了HRV16的2B真核表達(dá)載體p2B-GFP,轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,檢測ERS的相關(guān)蛋白和通路的激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HRV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B定位表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),且顯著增加了GRP78的表達(dá),同時,還激活了ATF4和ATF6,這些證據(jù)提示了HRV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B誘導(dǎo)了ERS。針對ERS通路激活情況的探討發(fā)現(xiàn),HRV16 2B蛋白顯著誘導(dǎo)了PERK的磷酸化、eIF2α的磷酸化和CHOP的表達(dá)增加。另外,]HRV16 2B蛋白使得RE1、p-IRE1的表達(dá)下降。關(guān)于ATF6的免疫印跡檢測未發(fā)現(xiàn)其明確的活化增加。這些結(jié)果表明HRV16 2B蛋白通過激活PERK-eIF2α信號通路介導(dǎo)了BHK-21細(xì)胞的ERS,而不是通過IRE1和ATF6通路。在研究中,我們還發(fā)現(xiàn)HRV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B表達(dá)于細(xì)胞后,細(xì)胞出現(xiàn)了核濃縮的凋亡現(xiàn)象,且PARP蛋白發(fā)生降解,這提示HRV162B蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)的HRV16非結(jié)構(gòu)蛋白2B對細(xì)胞ERS及凋亡的誘導(dǎo),為闡明鼻病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B的細(xì)胞損傷機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ),也為抗病毒藥物設(shè)計提供了新的潛在靶點。
【關(guān)鍵詞】：鼻病毒 非結(jié)構(gòu)蛋白2B 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 PERK-eIF2α
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 引言10-16
• 實驗材料與方法16-31
• 一、實驗材料16-21
• 二、實驗方法21-31
• 實驗結(jié)果31-41
• 一、重組質(zhì)粒p2B-GFP的構(gòu)建與鑒定31-33
• 二、HRV16 2B蛋白通過PERK-eIF2α信號通路誘導(dǎo)ERS33-38
• 三、HRV16 2B蛋白誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞凋亡38-41
• 討論41-47
• 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 綜述53-63
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 縮略詞對照表63-66
• 作者簡介66-68
• 致謝68-69
• 附錄69

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本文編號：781676