本文關鍵詞：差速貼壁法分離兔骨髓源性間充質干細胞和內皮祖細胞及其生物學特性的研究

  更多相關文章： 差速貼壁法 骨髓 間充質干細胞 內皮祖細胞 細胞培養(yǎng) 生物學特性

【摘要】：本研究探討一種高效、穩(wěn)定的從兔骨髓中同時分離培養(yǎng)間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)和內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)的方法并觀察其生物學特性。抽取兔骨髓,應用密度梯度分離單個核細胞,采用差速貼壁經纖連蛋白包被并結合EGM-2MV培養(yǎng)基分別擴增MSC和EPC。用臺盼藍法測定細胞傳代成活率,通過繪制生長曲線法、MTT法、DNA周期檢測MSC和EPC的增殖能力及誘導分化成骨細胞、成脂肪細胞能力,并結合流式細胞術(FCM)檢測MSC免疫原型以鑒定MSC;細胞吞噬功能特異性地攝取Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1,并結合CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫熒光鑒定EPC,并計算其純度。結果表明,經密度梯度分離單個核細胞,在早期貼壁細胞24 h換液時即可見明顯集落形成,8 d后達80%融合,細胞呈均勻一致的長梭形排列;2次貼壁細胞經EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng),第3天開始伸展,約8 d可融合近80%,細胞呈多角形,出現條索狀結構;2種細胞臺盼藍法測定細胞傳代成活率均在90%以上,傳至第2代后,生長曲線均近似"S"形;MTT法檢測顯示,細胞生長d 3至d 5時光密度值變化較明顯;MSC G0-G1期為(93.32±1.65)%、EPC G0-G1為(93.05±1.95)%,2種細胞DNA周期無明顯差異;早期貼壁細胞FCM檢測CD90、CD44陽性率為(99.7±1.12)%、(99.1±2.33)%;CD14、CD45、CD79a陽性率分別為(4.8±0.38)%、(6.8±0.49)%及(0.4±0.08)%,經體外誘導能夠向成骨細胞及脂肪細胞分化,鑒定為MSC;2次貼壁細胞傳至第2代經Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1雙熒光染色陽性率(82.1±3.4)%,CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫熒光染色陽性率分別為(74.2±3.2)%、(64.7±4.3)%及(43.5±1.5)%,鑒定為EPC。結論:應用密度梯度分離法結合差速貼壁篩選法可培養(yǎng)出高純度的MSC,2次貼壁細胞經纖連蛋白預包被并結合EGM-2MV培養(yǎng)基體外誘導可培養(yǎng)出增殖能力較強的EPC,為組織工程學研究提供種子細胞。
【作者單位】： 首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院;北京市心肺血管疾病研究所分子生物學研究室;
【關鍵詞】： 差速貼壁法 骨髓 間充質干細胞 內皮祖細胞 細胞培養(yǎng) 生物學特性
【基金】：國家自然科學基金資助項目(編號81170283) 北京市自然科學基金項目(編號7072012) 省部共建重點教育部心血管重塑相關疾病重點實驗室(編號110267) 首都醫(yī)科大學基礎-臨床合作基金重點課題(編號11JL09)
【分類號】：R329.28
【正文快照】： 骨髓中含有豐富的成體干細胞,如間充質干細胞(MSC)、造血干細胞(HSC)、內皮祖細胞(EPC)等,因此成體干細胞是一類具有定向分化和自我更新潛能的細胞,其臨床應用前景較為廣闊,使其成為近年來生命科學研究的熱點[1,2]。國內學者蔣晶晶等[3]、楊宇輝等[4]對大鼠及小鼠骨髓中同時

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