本文關(guān)鍵詞：人miR-152基因的慢病毒載體的構(gòu)建及穩(wěn)定株篩選

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【摘要】：目的構(gòu)建人miR-152基因重組慢病毒載體并篩選穩(wěn)定表達株。方法 PCR擴增包括miR-152前體所在區(qū)域的基因組DNA,克隆到慢病毒載體表達質(zhì)粒pGIPZ中,得到重組的pGIPZ-miR-152表達載體,通過與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞,獲得攜帶miR-152 minigene的重組慢病毒。用病毒感染HepG2細胞,72 h后用嘌呤霉素篩選。用real-time PCR法檢測miR-152基因的表達。結(jié)果構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗證和測序比對鑒定正確;該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞獲取的慢病毒滴度達7.5×107TU/mL;用病毒感染HepG2細胞,感染效率達70%以上。藥物篩選10 d后,獲得的過表達株miR-152表達量比正常細胞高近10倍。結(jié)論成功構(gòu)建人miR-152基因慢病毒載體質(zhì)粒pGIPZ-miR-152,并篩選出miR-152過表達細胞株,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
【作者單位】： 浙江大學附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科;南京醫(yī)科大學附屬南京婦幼保健院兒童保健科;
【關(guān)鍵詞】： miR- 慢病毒載體 HepG細胞
【基金】：國家自然科學基金項目(81270938) 創(chuàng)新研究群體科學基金
【分類號】：R346
【正文快照】： microRNAs(miRNA)是真核生物體內(nèi)一類大小約22 nt的非編碼RNA,其成熟體通過與mRNA的3'UTR(非編碼區(qū))互補配對結(jié)合,參與基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程,進而調(diào)節(jié)人類幾乎所有的生命活動過程和疾病的發(fā)生、發(fā)展。近年來,伴隨著肥胖而發(fā)生的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的發(fā)病率逐年提高[1

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本文編號：740193