發(fā)布時(shí)間：2017-08-21 17:11

  本文關(guān)鍵詞：二維和三維培養(yǎng)小鼠ADMSCs成心肌分化的效果比較

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【摘要】：背景心肌細(xì)胞的再生能力有限,目前心臟組織工程為心臟疾病后心肌細(xì)胞的修復(fù)和再生帶來了新的治療策略。在可移植的種子細(xì)胞中,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose Mesenchymal Stem Cells, ADMSCs)因其來源廣泛、取材方便,倫理限制較少,已成為心肌組織工程理想的種子細(xì)胞之一。Atelocollagen膠原具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性,可被制成三維立體支架,用作組織填充物和細(xì)胞培養(yǎng)支架。目前尚不知道ADMSCs是否可以在Atelocollagen支架上被培養(yǎng)成三維心肌。本研究試圖把誘導(dǎo)心肌化的ADMSCs中植在支架上,體外培養(yǎng)成立體心肌。目的探討小鼠ADMSCs在二維和三維培養(yǎng)條件下,利用不同誘導(dǎo)方法,評(píng)價(jià)誘導(dǎo)成心肌分化的效果,以及判斷三維培養(yǎng)后的ADMSCs在心臟內(nèi)的存活情況,為心肌組織工程提供實(shí)驗(yàn)參考。方法1.取小鼠腹股溝皮下脂肪組織,分離培養(yǎng)ADMSCs,傳至第3代后,用CD29+、CD45-標(biāo)記,流式細(xì)胞儀分選ADMSCs。2.使用成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)ADMSCs,對(duì)成骨誘導(dǎo)組行茜素紅染色,對(duì)成脂誘導(dǎo)組進(jìn)行油紅O染色,檢測(cè)其多向分化潛能。3.分別利用5-aza和將ADMSCs注射心肌組織內(nèi),誘導(dǎo)ADMSCs定向心肌分化,用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)心肌特異性標(biāo)記cTnT的表達(dá)情況。4.用DAPI、PKH26、GFP分別標(biāo)記ADMSCs后種植在Atelocollagen膠原支架上進(jìn)行三維培養(yǎng),觀察計(jì)算不同方法的標(biāo)記率。5.將ADMSCs種植于三維支架上分別經(jīng)5-aza和在大鼠心肌組織內(nèi)的微環(huán)境誘導(dǎo),在不同時(shí)間點(diǎn)觀察支架上的ADMSCs向心肌分化的情況,用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)心肌特異性標(biāo)記cTnT的表達(dá)。觀察Atelocollagen膠原支架在心肌內(nèi)降解時(shí)間,檢測(cè)支架內(nèi)ADMSCs縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá),分析移植的細(xì)胞與宿主心肌細(xì)胞是否發(fā)生功能聯(lián)系。結(jié)果1.分離培養(yǎng)的小鼠ADMSCs,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,CD29表達(dá)率為94%、而CD45陽性率僅為0.19%,符合目前國際上公認(rèn)的間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子特征,證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。2.成脂誘導(dǎo)14天,成骨誘導(dǎo)21天后,ADMSCs可分化為脂肪樣細(xì)胞和骨樣細(xì)胞,顯示ADMSCs具有多向分化潛能。3.5-aza和大鼠體內(nèi)心肌微環(huán)境均可使ADMSCs分化為心肌樣細(xì)胞,但心肌微環(huán)境的誘導(dǎo)分化效率明顯高于5-aza組,且具有時(shí)間依賴性,體內(nèi)移植組1周分化效率(42.93±4.04)%大于5-aza組3周的效率(33.33±3.79)%,P0.05。4. DAPI、PKH26、GFP三種方法標(biāo)記后的ADMSCs可在Atelocollagen膠原支架上生長(zhǎng)并增殖,標(biāo)記率分別為DAPI(92.7%)、PKH26(89.2%)、GFP(95%)。5.3d時(shí)移植的支架內(nèi)可見極少量ADMSCs,大部分移植細(xì)胞遷移至支架外。7d時(shí)部分移植細(xì)胞cTnT呈陽性,Cx43呈陰性,13d時(shí)支架完全降解。支架上的細(xì)胞在5-aza誘導(dǎo)和在體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)均能使ADMSCs向心肌方向分化。結(jié)論 (1)大鼠體內(nèi)心肌微環(huán)境對(duì)小鼠ADMSCs定向心肌分化誘導(dǎo)效率高于體外5-aza誘導(dǎo)。(2)ADMSCs可在Atelocollagen膠原支架上良好生長(zhǎng)并增殖,體外經(jīng)5-aza誘導(dǎo)和體內(nèi)心肌微環(huán)境誘導(dǎo)均能使ADMSCs分化為心肌細(xì)胞,但移植到心肌內(nèi)后,支架上細(xì)胞遷移至支架外,并部分分化為心肌樣細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：大鼠心臟 5-aza 心肌微環(huán)境 膠原支架 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 三維培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-24
• 結(jié)果24-37
• 討論37-41
• 小結(jié)41-43
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 綜述：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建心肌組織的研究進(jìn)展48-64
• 參考文獻(xiàn)57-64
• 附錄64-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況65-66
• 致謝66-67
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷67

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1 常丹陽;二維和三維培養(yǎng)小鼠ADMSCs成心肌分化的效果比較[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

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本文編號(hào)：714099