本文關(guān)鍵詞：人誘導(dǎo)共刺激分子配體ICOSL單克隆抗體及ELISA試劑盒的研制及應(yīng)用

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【摘要】：T細(xì)胞活化需要雙信號:第一信號是TCR(T cell receptor)識別抗原提呈細(xì)胞表面抗原肽-MHC復(fù)合物,第二信號是T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞共刺激分子之間的互相作用,共同決定T細(xì)胞的活化增殖,維持并調(diào)節(jié)活化級聯(lián)反應(yīng),抑或轉(zhuǎn)變?yōu)闊o反應(yīng)狀態(tài)甚至凋亡。正性共刺激分子ICOS(inducible costimulator)與其配體ICOSL(inducible costimulator ligand)相互作用后能有效地促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、活化和細(xì)胞因子的分泌等,還會參與Tfh(T follicular helper cells)增殖分化和生發(fā)中心反應(yīng),從而對B細(xì)胞分泌抗體發(fā)揮作用。同時ICOS/ICOSL信號通路在自身免疫性疾病、移植免疫、腫瘤免疫乃至感染性免疫的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學(xué)功能。正性共刺激分子ICOSL以兩種形式存在:可溶型和膜型。膜型ICOSL分子一定程度表達(dá)在活化的B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和部分T細(xì)胞亞群,也可誘導(dǎo)表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞上。ICOSL與其表達(dá)在T細(xì)胞上的受體ICOS結(jié)合,可以不依賴于B7/CD28通路作用于T細(xì)胞發(fā)揮功能。ICOS分子胞內(nèi)段含有一個“YMFM”基序,可與PI3K結(jié)合發(fā)揮其激酶活性,作用于下游信號通路,即ICOS/ICOSL信號途徑會激活T細(xì)胞內(nèi)依賴PI3K的信號途徑。一般情況下可溶性共刺激分子可以通過專一的mRNA編碼經(jīng)免疫細(xì)胞直接分泌產(chǎn)生,也可以由膜型分子經(jīng)蛋白水解酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶等)的裂解而形成。臨床資料分析顯示,部分可溶性共刺激分子具有臨床診斷的價值,然而機(jī)體中是否存在可溶性ICOSL,它是通過何種機(jī)制產(chǎn)生的,表達(dá)特性如何,在對膜型ICOS/ICOSL的調(diào)節(jié)作用中扮演何種角色,在臨床疾病的免疫病理中發(fā)揮何種生物學(xué)作用等,這些問題還有待研究。因此,ICOS/ICOSL信號通路對T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。通過研究ICOS/ICOSL的表達(dá)及其介導(dǎo)的信號通路與臨床疾病的關(guān)系,闡明其在免疫病理中的作用和機(jī)理,可以為某些疾病的免疫診斷和免疫治療尋求新的途徑。本課題研究旨在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/ICOSL的基礎(chǔ)上,研制出特異性的鼠抗人ICOSL單克隆抗體,同時分析其生物學(xué)特性,進(jìn)一步探究單抗對ICOS/ICOSL途徑的調(diào)節(jié)作用和對T細(xì)胞增殖及其細(xì)胞因子分泌的影響;并應(yīng)用所得單抗研制特異性檢測人可溶性icosl(sicosl)的elisa試劑盒,對試劑盒的精確性和穩(wěn)定性進(jìn)行評價;利用研制的elisa試劑盒檢測健康志愿者和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血可溶性icosl的表達(dá)水平,探究sicosl可能的產(chǎn)生機(jī)制,進(jìn)而探討該可溶性因子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫病理中的臨床意義。上述研究結(jié)果為闡明膜型icosl和可溶型icosl的生物學(xué)意義及icos/icosl在自身免疫性疾病中的作用提供了新的線索。一、鼠抗人icosl單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究【目的】研制特異性鼠抗人icosl單克隆抗體,為探究人icosl分子在不同細(xì)胞上或多種疾病中的表達(dá)奠定物質(zhì)基礎(chǔ),并為探討icos/icosl信號通路的生物學(xué)意義提供物質(zhì)材料�！痉椒ā恳愿弑磉_(dá)人icosl分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞l929/icosl免疫balb/c小鼠,采用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)將骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合,運用流式細(xì)胞術(shù)對雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行初篩,將合格的雜交瘤細(xì)胞株反復(fù)檢測和亞克隆,成功獲得兩株特異性好且能夠持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人icosl單抗的雜交瘤細(xì)胞株;采取cba法和快速定性試紙法鑒定抗體亞型;通過westernblot、dotblot、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和elisa以及兩株單抗之間或單抗與蛋白之間的競爭結(jié)合抑制實驗分析所得單抗的生物學(xué)特性;用流式細(xì)胞術(shù)和間接免疫熒光分析icosl在多種腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)水平;研究所得單抗在人t細(xì)胞體外增殖實驗中的生物學(xué)功能。【結(jié)果】1、成功獲得兩株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人icosl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株:13d11和20b10。這兩株單抗可用于流式細(xì)胞術(shù)、westernblot、dotblot、elisa、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)的檢測分析;2、競爭抑制實驗表明,兩株單抗識別icosl分子不同的抗原表位,且都與商品化單抗2d3不同;兩株單抗均能有效阻斷icos/icosl的結(jié)合;3、t細(xì)胞體外增殖實驗結(jié)果表明,單克隆抗體13d11可抑制活化t細(xì)胞的體外增殖,且其抑制作用隨單抗?jié)舛鹊脑黾佣鰪?qiáng)。【結(jié)論】成功獲得兩株特異性鼠抗人icosl單克隆抗體,兩者識別icosl不同的抗原表位,為研制檢測人可溶性icosl的elisa試劑盒,進(jìn)一步用來測定可溶性icosl的表達(dá)水平奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ);也為分析膜型icosl的表達(dá)特性,探討icos/icosl信號通路對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)及其生物學(xué)功能提供必要的物質(zhì)材料。二、特異性檢測人可溶性icosl蛋白elisa試劑盒的研制【目的】研制穩(wěn)定靈敏的特異性檢測人sicosl的elisa試劑盒,為定量分析臨床來源的標(biāo)本和研究可溶性icosl的生物學(xué)意義提供有潛在應(yīng)用價值的檢測試劑�！痉椒ā窟\用anti-icoslmab(20b10)作為包被抗體,在包被液(即碳酸鹽緩沖液)中包被elisa板,4℃避光過夜,biotin-anti-icoslmab(2b4)作為檢測抗體,識別已與20b10相結(jié)合的抗原,再加入streptavidin-hrp反應(yīng),最后用tmb底物顯色,即雙抗體夾心法建立sicosl的elisa檢測體系。利用同一次實驗多孔檢測的方法分析試劑盒的精確性,利用同一次實驗elisa板的不同測定時間的準(zhǔn)確性分析試劑盒穩(wěn)定性�！窘Y(jié)果】建立穩(wěn)定、靈敏的特異性檢測人sicosl的elisa試劑盒,且試劑盒能特異性測定人sicosl,而不識別其他蛋白,試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線在sicosl蛋白0.156~10ng/ml的范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。這種方法有良好的精確性和穩(wěn)定性,離散度(cv%)分別為10.9%和3.65%�！窘Y(jié)論】研制出特異性檢測人sicosl的elisa試劑盒,為定量分析可溶性icosl的生物學(xué)功能和臨床價值提供了有效的檢測手段。三、可溶性icosl的表達(dá)特性及其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的臨床意義【目的】檢測健康人外周血中sicosl的表達(dá)水平,揭示機(jī)體sicosl的產(chǎn)生機(jī)制,探討sicosl在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)患者外周血異常表達(dá)的臨床意義。【方法】應(yīng)用第二部分研制的特異性檢測人sicosl的elisa試劑盒分析各年齡層健康志愿者外周血中sicosl的表達(dá)特性;在高表達(dá)可溶性icosl的l929/icosl細(xì)胞培養(yǎng)液中加入金屬蛋白酶抑制劑(mmpi),設(shè)空白對照,在不同時間點分析sicosl的表達(dá)水平;人淋巴細(xì)胞分離液(ficoll)加磁珠分選獲得cd14+單核細(xì)胞和cd19+b細(xì)胞,加入mmpi,同時設(shè)空白對照,體外刺激活化后,運用elisa和流式檢測可溶型和膜型icosl的表達(dá)水平,elisa檢測培養(yǎng)上清中可溶性mmp-2和mmp-9的表達(dá)水平。流式檢測45例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和39例健康志愿者(healthycontrol,hc)外周血cd4+、cd8+t細(xì)胞表面icos及cd14+單核細(xì)胞、cd19+b細(xì)胞表面icosl的表達(dá)特性;利用自主研制的sicoslelisa試劑盒分析血漿可溶性icosl的表達(dá)。用統(tǒng)計學(xué)軟件將測得的數(shù)據(jù)與臨床各項指標(biāo)作相關(guān)性分析,評價其臨床意義。【結(jié)果】1、elisa檢測結(jié)果顯示,sicosl存在于人外周血中,且表達(dá)水平與年齡、性別有一定的相關(guān)性;2、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(mmpi)能抑制l929/icosl轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或過度活化的cd14+單核細(xì)胞和cd19+b細(xì)胞培養(yǎng)上清中sicosl的表達(dá),且與對照組相比,實驗組mmp-2和mmp-9的表達(dá)下調(diào);3、與健康對照(hc)相比,sle患者外周血cd4+、cd8+t細(xì)胞表面icos的表達(dá)均顯著升高(19.07±1.74)%vs(13.99±1.54)%、(10.04±0.99)%vs(6.36±0.99)%,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),cd14+單核細(xì)胞上icosl的表達(dá)高于健康對照[(2.94±0.88)%vs(0.89±0.21)%,(p=0.04)],且與患者血漿c3和c4水平呈正相關(guān)[(r=0.40,p=0.031),(r=0.44,p=0.017)]�；顒悠诮Msle患者血漿sicosl的濃度顯著高于非活動期組[(361.5±25.28)(ng/ml)vs(278±14.75)(ng/ml),(p=0.025)],且與cd14+單核細(xì)胞和cd19+b細(xì)胞表面icosl的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)[(r=-0.4243,p=0.022)、(r=-0.4099,p=0.025)]�！窘Y(jié)論】人外周血中存在可溶性icosl,且mmp是其可能的產(chǎn)生機(jī)制之一。sle患者外周血淋巴細(xì)胞表面icos和icosl以及血漿sicosl表達(dá)水平顯著增加,且與疾病活動度密切相關(guān)。提示icos/icosl途徑可能參與sle免疫病理過程。綜上所述,本研究獲得以下結(jié)果:(1)研制出2株鼠抗人icosl單克隆抗體,可用于流式細(xì)胞術(shù)、westernblot、dotblot和elisa等研究;功能性鼠抗人icosl單抗13d11能抑制icos/icosl介導(dǎo)的t細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌。(2)建立了特異性檢測人sicosl的elisa方法,而且這個方法具有良好的精確性和穩(wěn)定性。(3)利用研制的sicoslelisa試劑盒分析表明,健康人外周血中存在sicosl,且金屬蛋白酶(MMPs)剪切機(jī)制是s ICOSL的產(chǎn)生機(jī)制之一;SLE患者外周血淋巴細(xì)胞表面ICOS和ICOSL及血漿sICOSL均表達(dá)異常,并且與疾病活動度密切相關(guān),表明ICOS/ICOSL途徑可能參與SLE免疫病理進(jìn)程。
【關(guān)鍵詞】：ICOSL 單克隆抗體 ELISA 可溶性ICOSL 共刺激作用
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392.11
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-15
• 研究背景15-27
• 一、ICOSL的分子結(jié)構(gòu)與表達(dá)特性15-16
• 二、ICOSL的免疫學(xué)作用及作用機(jī)制16-18
• 三、ICOSL與疾病18-21
• 四、鼠抗人ICOSL單克隆抗體研制的應(yīng)用前景21-22
• 五、可溶性共刺激分子在免疫應(yīng)答中的作用22-23
• 參考文獻(xiàn)23-27
• 第一部分 鼠抗人ICOSL單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究27-44
• 1 主要試劑與材料28
• 2 方法28-33
• 3 結(jié)果33-39
• 4 討論39-41
• 參考文獻(xiàn)41-44
• 第二部分 特異性檢測人可溶性ICOSL蛋白ELISA試劑盒的研制44-52
• 1 主要試劑與材料44-45
• 2 方法45-46
• 3 結(jié)果46-49
• 4 討論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-52
• 第三部分 可溶性ICOSL的表達(dá)特性及其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的臨床意義52-66
• 1 主要試劑與材料53
• 2 方法53-55
• 3 結(jié)果55-61
• 4 討論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 結(jié)論與展望66-68
• 縮寫詞表68-70
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文70-71
• 本課題獲得的基金資助71-72
• 致謝72-74

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本文編號：710433