發(fā)布時間：2017-08-21 01:13

  本文關(guān)鍵詞：呼吸道合胞病毒雙順反子微型基因組的構(gòu)建及拯救

  更多相關(guān)文章： 呼吸道合胞病毒 微型基因組 雙順反子 輔助蛋白 密碼子優(yōu)化

【摘要】：目的：構(gòu)建可表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)或分泌型熒光素酶(Gaussia luciferase, Gluc)報告基因的單/雙順反子人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)微型基因組cDNA克隆并進(jìn)行拯救,以探討并驗(yàn)證RSV的輔助蛋白在RSV反向遺傳學(xué)操作中的作用,同時,構(gòu)建以巨細(xì)胞病毒(Cytomegalo virus, CMV)啟動子為表達(dá)盒、密碼子優(yōu)化的輔助蛋白質(zhì)粒系統(tǒng),用于開展微型基因組拯救及RSV輔助蛋白功能的研究。方法：通過分子生物學(xué)技術(shù),將人工合成的帶EGFP基因的微型基因組cDNA克隆在改造的pBR322B載體上；將EGFP基因替換為Gluc報告基因,獲得分別表達(dá)EGFP及Glue的單順反子微型基因組,向上述質(zhì)粒中插入一個編碼無生物活性的蛋白的開放閱讀框(open reading frame, ORF),獲得分別表達(dá)EGFP或Gluc的雙順反子微型基因組。同時,構(gòu)建基于CMV啟動子表達(dá)盒及密碼子優(yōu)化的輔助蛋白質(zhì)粒系統(tǒng),Western blot鑒定輔助蛋白質(zhì)粒的蛋白表達(dá),并與之前構(gòu)建的基于T7啟動子表達(dá)盒的輔助蛋白質(zhì)粒比較拯救微型基因組的效率。將以EGFP或Gluc為報告基因的單/雙順反子微型基因組分別與輔助蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至BHK-T7細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)、Gluc檢測試劑盒分析Gluc的表達(dá),以及RT-qPCR對EGFP mRNA水平進(jìn)行檢測,以實(shí)現(xiàn)對微型基因組的拯救及驗(yàn)證RSV四種輔助蛋白在拯救過程中的作用。結(jié)果：構(gòu)建了以EGFP或Gluc為報告基因的單/雙順反子微型基因組及其編碼質(zhì)粒,以及基于CMV啟動子表達(dá)盒及密碼子優(yōu)化的輔助蛋白質(zhì)粒系統(tǒng)。成功拯救了攜帶EGFP或Gluc報告基因的單/雙順反子微型基因組,并驗(yàn)證了四種輔助蛋白在拯救過程中的生物學(xué)意義,其中M2-1具有抑制轉(zhuǎn)錄終止和促進(jìn)亞基因組轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)活性。研究也表明以CMV啟動子表達(dá)盒和密碼子優(yōu)化為基礎(chǔ)的輔助蛋白質(zhì)粒較以T7啟動子表達(dá)盒的輔助蛋白質(zhì)粒拯救效率有所提高。結(jié)論：成功構(gòu)建了編碼可表達(dá)EGFP或Gluc報告基因的單/雙順反子微型基因組的重組質(zhì)粒,并驗(yàn)證了四種輔助蛋白、尤其是M2-1蛋白在雙順反子微型基因組的拯救過程中具有轉(zhuǎn)錄延長的生物學(xué)活性,同時,發(fā)現(xiàn)以CMV啟動子表達(dá)盒和密碼子優(yōu)化為基礎(chǔ)的輔助蛋白質(zhì)粒能高效進(jìn)行拯救,適用于后續(xù)的RSV重組病毒拯救實(shí)驗(yàn)研究。
【關(guān)鍵詞】：呼吸道合胞病毒 微型基因組 雙順反子 輔助蛋白 密碼子優(yōu)化
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R373.14
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 1 引言12-16
• 2 實(shí)驗(yàn)材料16-21
• 2.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞16
• 2.2 工具酶、試劑盒和抗體16
• 2.3 實(shí)驗(yàn)耗材16-17
• 2.4 主要生化試劑17
• 2.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器17-18
• 2.6 主要溶液配制18-21
• 3 實(shí)驗(yàn)方法21-41
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)21
• 3.2 表達(dá)EGFP/GLuc的單順反子RSV微型基因組的構(gòu)建21-28
• 3.2.1 pBR322B載體的改造21-24
• 3.2.2 可表達(dá)EGFP的單順反子微型基因組的構(gòu)建及鑒定24-26
• 3.2.3 可表達(dá)Gluc的單順反子微型基因組的構(gòu)建及鑒定26-28
• 3.3 可表達(dá)EGFP/Gluc的雙順反子RSV微型基因組的構(gòu)建28-31
• 3.3.1 可表達(dá)EGFP的雙順反子微型基因組的構(gòu)建及鑒定28-29
• 3.3.2 可表達(dá)Gluc的雙順反子微型基因組的構(gòu)建及鑒定29-30
• 3.3.3 可表達(dá)EGFP/Gluc的RSV單/雙順反子微型基因組的構(gòu)建流程30-31
• 3.4 以CMV啟動子為表達(dá)盒的輔助蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建31-32
• 3.5 輔助蛋白質(zhì)粒的蛋白表達(dá)鑒定32-34
• 3.5.1 pcDNA3.1-N-OPT、pcDNA3.1-P-OPT和pcDNA3.1-M2-1-OPT的蛋白表達(dá)鑒定32-33
• 3.5.2 pcDNA3.1-L-OPT的蛋白表達(dá)鑒定33-34
• 3.6 拯救RSV單/雙順反子微型基因組與報告基因表達(dá)的檢測34-38
• 3.6.1 多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染拯救可表達(dá)EGFP的單/雙順反子微型基因組34-36
• 3.6.2 多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染拯救可表達(dá)Gluc的RSV單/雙順反子微型基因組36-38
• 3.7 RT-qPCR檢測RSV-EGFP 雙順反子報告基因的轉(zhuǎn)錄水平38-40
• 3.7.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA的提取38
• 3.7.2 RT-PCR合成cDNA第一鏈38-39
• 3.7.3 qPCR定量檢測報告基因的mRNA39-40
• 3.8 基于CMV啟動子表達(dá)盒與T7啟動子表達(dá)盒的輔助蛋白質(zhì)粒拯救微型基因組效率的比較40-41
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-55
• 4.1 EGFP/Gluc的單/雙順反子的微型基因組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定41-45
• 4.1.1 pBR322B載體的構(gòu)建和鑒定41
• 4.1.2 EGFP/Gluc的單順反子的微型基因組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定41-43
• 4.1.3 EGFP/Gluc的雙順反子的微型基因組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定43-45
• 4.2 以CMV啟動子表達(dá)盒為基礎(chǔ)的輔助蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定45-47
• 4.2.1 輔助蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切鑒定45-46
• 4.2.2 輔助蛋白質(zhì)粒的蛋白表達(dá)鑒定46-47
• 4.3 可表達(dá)EGFP的單/雙順反子微型基因組的拯救及熒光表達(dá)47-50
• 4.4 可表達(dá)Gluc的單/雙順反子微型基因組的拯救及熒光定量檢測50-52
• 4.5 RT-qPCR定量檢測EGFP mRNA水平52-53
• 4.6 以CMV啟動子和T7啟動子為表達(dá)盒的的輔助蛋白質(zhì)粒拯救微型基因組效率的比較53-55
• 5 討論55-58
• 6 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 附錄61-62
• 作者簡歷及攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果62-64
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集64

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本文編號：709962