本文關(guān)鍵詞：利用脂肪細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠研究Metrnl表達(dá)和功能

  更多相關(guān)文章： Metrnl ELISA 脂肪細(xì)胞 胰島素敏感性 腸上皮細(xì)胞 抗菌肽

【摘要】：背景脂肪因子在調(diào)控脂肪組織功能和機(jī)體代謝方面發(fā)揮著重要作用。Metrnl是我們課題組新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子。該蛋白在機(jī)體多種組織中表達(dá),尤其在白色脂肪和粘膜組織中高表達(dá)。目前文獻(xiàn)報(bào)道,Metrnl具有神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用,促進(jìn)軸突生長和神經(jīng)細(xì)胞遷移;脂肪形成和肥胖時(shí)Metrnl表達(dá)上調(diào)。本課題研究Metrnl組織表達(dá)譜,聚焦于Metrnl高表達(dá)的脂肪組織和腸道組織,通過創(chuàng)制細(xì)胞特異性基因敲除小鼠探索Metrnl功能。方法1.考察小鼠Metrnl ELISA試劑盒的靈敏度、精確度、特異性等,建立一套穩(wěn)定準(zhǔn)確的Metrnl檢測(cè)方法。2.利用Metrnlloxp/loxp小鼠和Fabp4-Cre小鼠交配,制備Metrnl脂肪細(xì)胞特異性敲除小鼠。3.正常飲食下,取Metrnl脂肪細(xì)胞特敲小鼠和野生型小鼠脂肪組織、肝臟、肌肉、心臟和腦組織檢測(cè)Metrnl mRNA水平,利用ELISA方法檢測(cè)Metrnl血液水平。另外,監(jiān)測(cè)小鼠能量消耗和進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)。高脂飲食下,監(jiān)測(cè)Metrnl脂肪細(xì)胞特敲小鼠和野生型小鼠能量消耗,并進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。HE染色觀察小鼠白色脂肪組織形態(tài)和real-time PCR分析棕色脂肪脂代謝和產(chǎn)熱相關(guān)基因表達(dá)。4.利用正常人組織芯片進(jìn)行Metrnl免疫組織化學(xué)分析,以及利用real-time PCR方法分析C57BL/6小鼠組織Metrnl mRNA表達(dá)。5.利用Metrnlloxp/loxp小鼠和Villin-Cre小鼠交配,制備Metrnl腸上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠。6.考察Metrnl腸上皮細(xì)胞特敲小鼠和野生型小鼠體重和結(jié)腸長度,HE染色觀察結(jié)腸形態(tài)和利用ELISA方法檢測(cè)血液和腸液Metrnl水平。腸道粘液染色分析腸道粘蛋白的分泌,以及利用real-time PCR方法分析腸上皮細(xì)胞中抗菌肽mRNA表達(dá)水平如Regenerating islet-derived 3 gamma(Reg3g)、Lactortansfferin、Serum amyloid a-3(SAA3)和Regenerating islet-derived 3 beta(Reg3b)。結(jié)果1.建立了一套成熟穩(wěn)定準(zhǔn)確的Metrnl ELISA檢測(cè)方法。該方法靈敏度高,精密度的變異系數(shù)為5-15%,且只能由于檢測(cè)小鼠血液Metrnl,大鼠和人血液都不能檢測(cè)。另外,小鼠血液的采集方法必須一致,否則影響Metrnl值的比較。2.成功制備Metrnl脂肪細(xì)胞特異性敲除小鼠模型。脂肪組織Metrnl表達(dá)下降57%,而肝臟、肌肉、心臟和腦組織Metrnl表達(dá)不改變。Metrnl脂肪細(xì)胞特異性敲除后小鼠血液水平有降低趨勢(shì),無顯著差異。3.正常飲食下,與野生型小鼠相比,Metrnl脂肪細(xì)胞特異性敲除小鼠的能量消耗和葡萄糖耐受能力不受影響。高脂飲食下,與野生型小鼠相比,Metrnl脂肪細(xì)胞特敲小鼠白色脂肪細(xì)胞顯著變小,機(jī)體胰島素抵抗加重,但棕色脂肪脂代謝和產(chǎn)熱相關(guān)基因mRNA表達(dá)無明顯變化。4.正常人組織Metrnl免疫組化和C57BL/6小鼠組織Metrnl mRNA表達(dá)水平表明,Metrnl在人和小鼠組織中表達(dá)譜幾乎一致,且腸上皮細(xì)胞Metrnl表達(dá)最高。5.成功制備Metrnl腸上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠模型。腸上皮細(xì)胞Metrnl表達(dá)下降96%,而肝臟、肌肉、心臟和脂肪組織Metrnl表達(dá)不改變。Metrnl腸上皮細(xì)胞特敲后小鼠血液水平有降低趨勢(shì)無顯著差異,而腸液Metrnl水平顯著降低。6.與野生型小鼠相比,Metrnl腸上皮細(xì)胞特敲小鼠體重和結(jié)腸長度,結(jié)腸形態(tài)也沒有顯著變化。腸道粘液染色沒有發(fā)現(xiàn)其分泌有明顯變化,腸上皮Mucin2表達(dá)也沒有差異。但腸上皮細(xì)胞中抗菌肽mRNA表達(dá)減少如Reg3g和Lactotransfferin分泌顯著減少,SAA3和Reg3b有減少趨勢(shì)。結(jié)論Metrnl脂肪細(xì)胞特異性敲除不會(huì)引起血液Metrnl水平顯著下降;Metrnl腸上皮細(xì)胞特異性敲除不會(huì)引起血液Metrnl水平顯著下降,但導(dǎo)致腸液Metrnl水平顯著降低。脂肪細(xì)胞Metrnl能增強(qiáng)機(jī)體胰島素敏感性;腸上皮細(xì)胞Metrnl能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞抗菌肽表達(dá),Metrnl可能參與腸道免疫調(diào)節(jié)。
【關(guān)鍵詞】：Metrnl ELISA 脂肪細(xì)胞 胰島素敏感性 腸上皮細(xì)胞 抗菌肽
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-12
• 前言12-16
• 一、實(shí)驗(yàn)材料16-19
• （一）試劑和耗材16-17
• （二）實(shí)驗(yàn)儀器17-19
• 二、實(shí)驗(yàn)方法19-29
• （一）小鼠基因型鑒定19-20
• （二）小鼠體重、食量記錄和能量消耗測(cè)定20-21
• （三）葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)21
• （四）胰島素耐量實(shí)驗(yàn)21-22
• （五）小鼠血液標(biāo)本和腸液標(biāo)本采集22
• （六）組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)22-24
• （七）Metrnl等基因mRNA表達(dá)檢測(cè)24-26
• （八）Metrnl免疫組織化學(xué)檢測(cè)26
• （九）Metrnl ELISA檢測(cè)26-29
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論29-43
• （一）Metrnl ELISA方法學(xué)考察29-32
• 1. 檢測(cè)方法的靈敏度29
• 2. 檢測(cè)方法的精密度29-30
• 3. 檢測(cè)上限的延伸30
• 4. 檢測(cè)方法的種屬特異性30-31
• 5. 不同血液的采集方法對(duì)Metrnl的影響31-32
• （二）Metrnl脂肪細(xì)胞特敲小鼠培育和胰島素敏感性研究32-38
• 1. Metrnl脂肪細(xì)胞特異性敲除小鼠的培育32
• 2. Metrnl脂肪細(xì)胞特異性敲除小鼠的驗(yàn)證32-33
• 3. 正常飲食下，Metrnl對(duì)小鼠體重、食量和能量消耗的影響33
• 4. 正常飲食下，，Metrnl脂肪細(xì)胞特敲對(duì)胰島素敏感性的影響33-34
• 5. 高脂飲食下，Metrnl對(duì)小鼠體重、食量和能量消耗的影響34
• 6. 高脂飲食下，Metrnl脂肪細(xì)胞特敲對(duì)胰島素敏感性的影響34-35
• 7. 高脂飲食下，Metrnl對(duì)小鼠肝臟和脂肪組織重量的影響35-36
• 8. 高脂飲食下，Metrnl對(duì)棕色脂肪脂代謝和產(chǎn)熱功能的影響36
• 9. 高脂飲食下，Metrnl脂肪細(xì)胞特敲對(duì)白色脂肪組織形態(tài)的影響36-38
• （三）Metrnl腸上皮細(xì)胞特敲小鼠培育和功能探索38-43
• 1. 正常人組織Metrnl表達(dá)譜38
• 2. C57BL/6 小鼠組織Metrnl表達(dá)譜38-39
• 3. Metrnl腸上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠的培育39-40
• 4. Metrnl腸上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠的驗(yàn)證40
• 5. Metrnl腸上皮細(xì)胞特敲小鼠體重和結(jié)腸形態(tài)學(xué)觀察40-41
• 6. Metrnl腸上皮細(xì)胞特敲小鼠血液和腸液Metrnl水平41
• 7. Metrnl對(duì)小鼠腸道粘液分泌和抗菌肽表達(dá)的影響41-43
• 全文總結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 綜述48-59
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況59-60
• 附錄60-72
• 致謝72

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