發(fā)布時(shí)間：2017-08-20 13:00

  本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌表面展示結(jié)核分枝桿菌PepA、PPE18和EsxH蛋白及其免疫原性研究

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【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的人、畜、禽共患的慢性消耗性傳染病,與艾滋病及瘧疾共同成為人類健康的三大威脅。2013年,有900萬人罹患結(jié)核病,150萬人死于該病。隨著耐藥結(jié)核分枝桿菌的散播及艾滋病蔓延,對(duì)結(jié)核病的控制與防治面臨著巨大挑戰(zhàn)。但是,目前已報(bào)道的針對(duì)結(jié)核病的幾種疫苗都有一定的局限性。接種卡介苗(BCG)是預(yù)防結(jié)核病的主要方式,但存在保護(hù)效率低、免疫保護(hù)效果有限等問題;DNA疫苗的有效性仍有待提高;亞單位疫苗的免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間短、應(yīng)用受限,因此發(fā)展高效、安全并可廣泛應(yīng)用的新型結(jié)核疫苗已迫在眉睫。本研究通過構(gòu)建細(xì)菌表面展示載體,在大腸桿菌表面展示結(jié)核分枝桿菌PepA、PPE18和EsxH蛋白,對(duì)其免疫效果進(jìn)行研究,評(píng)價(jià)其作為活載體疫苗應(yīng)用于結(jié)核病防控的潛力。本研究將PepA、PPE18和EsxH的編碼基因rv0125、rv1196、rv0288及三個(gè)基因的融合基因rv0288-1196-0125分別克隆于構(gòu)建的INP表面展示載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,通過不同方法驗(yàn)證外源蛋白的表達(dá)定位和表達(dá)量。免疫印跡結(jié)果顯示,三個(gè)編碼基因及融合基因均有表達(dá),可檢測(cè)到預(yù)期大小的蛋白條帶;對(duì)亞細(xì)胞組分的檢測(cè)結(jié)果顯示,目的蛋白均定位于細(xì)胞膜與細(xì)胞壁;進(jìn)一步應(yīng)用蛋白酶K作用后,特異性的目的蛋白被消化,被降解為許多小分子量氨基酸肽段;激光共聚焦顯微鏡下可觀察到免疫染色后細(xì)菌表面的特異性熒光信號(hào)。以小鼠為動(dòng)物模型,用所構(gòu)建的表面展示活疫苗載體經(jīng)腹腔注射免疫小鼠,定期采取血清、分離脾臟淋巴細(xì)胞,分別檢測(cè)抗體水平、細(xì)胞因子水平、CD4+和CD8+水平,分析免疫效果。研究結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,各免疫組抗體水平均有較大程度的提升,在三免二周后,INP-0288組的抗體水平為空載體對(duì)照組的4倍,既使抗體水平最低的INP-0288-1196-0125組也為空載體對(duì)照組2倍,顯示上述表面展示活疫苗載體能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)所展示蛋白的高水平特異性抗體。各免疫組CD4+T細(xì)胞呈現(xiàn)上升趨勢(shì),而對(duì)于CD8+T細(xì)胞,INP-0288免疫組呈現(xiàn)上升趨勢(shì),其余三組呈現(xiàn)上升后輕微下降的趨勢(shì),但水平均高于對(duì)照組;INP-0288組的CD4+/CD8+表現(xiàn)為上升后輕微下降的趨勢(shì),其余三組呈現(xiàn)出下降后上升的趨勢(shì)。細(xì)胞因子水平存在明顯差異:對(duì)于IFNγ,相比于空白組各免疫組水平均表現(xiàn)為下降,水平低于空白組;對(duì)于IL-4,各時(shí)間點(diǎn)各免疫組水平明顯提高;IL-17A的檢測(cè)中,相比于空白組,INP-0288組明顯升高,而其余三組表現(xiàn)為水平降低。綜上所述,本研究利用所構(gòu)建的表面展示載體INP,將結(jié)核分枝桿菌PepA、PPE18、EsxH及其融合蛋白展示于大腸桿菌表面,所構(gòu)建的4種蛋白表面展示活疫苗載體均能夠在小鼠中激發(fā)強(qiáng)烈的體液與細(xì)胞免疫。本研究為新型結(jié)核疫苗的研制奠定了良好的基礎(chǔ),為結(jié)核病的防控提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：分枝桿菌 表面展示 PepA PPE18 EsxH
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-22
• 1.1 結(jié)核病簡(jiǎn)介12-16
• 1.1.1 結(jié)核病病原學(xué)12-13
• 1.1.2 結(jié)核病流行病學(xué)13-14
• 1.1.3 結(jié)核病的防控14-16
• 1.2 細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的發(fā)展與應(yīng)用16-18
• 1.3 冰核蛋白展示系統(tǒng)18
• 1.4 PepA, PPE18, EsxH18-21
• 1.5 研究目的和意義21-22
• 第二章 結(jié)核分枝桿菌PepA、PPE18和Esx H蛋白表面展示疫苗載體的構(gòu)建22-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 2.1.1 載體和菌株22
• 2.1.2 主要試劑22
• 2.1.3 主要儀器22
• 2.1.4 主要溶液及培養(yǎng)基22-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-29
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)與基因PCR擴(kuò)增24-25
• 2.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建25-26
• 2.2.3 重組菌的構(gòu)建26
• 2.2.4 激光共聚焦檢測(cè)26-27
• 2.2.5 目的蛋白的SDS-PAGE、免疫印跡檢測(cè)27
• 2.2.6 目的蛋白超速離心法分離組分27
• 2.2.7 目的蛋白蛋白酶K處理27-28
• 2.2.8 目的蛋白激光共聚焦觀察28-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-36
• 2.3.1 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果29-30
• 2.3.2 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果30
• 2.3.3 EGFP激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果30-31
• 2.3.4 目的蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果31-32
• 2.3.5 目的蛋白超速離心法分離組分結(jié)果32-34
• 2.3.6 目的蛋白的蛋白酶K消化結(jié)果34-35
• 2.3.7 目的蛋白激光共聚焦觀察結(jié)果35-36
• 2.4 討論36-37
• 第三章 結(jié)核分枝桿菌PepA, PPE18和Esx H蛋白表面展示疫苗免疫效果評(píng)價(jià)37-48
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料37-38
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物37
• 3.1.2 試劑37
• 3.1.3 主要儀器37
• 3.1.4 主要溶液37-38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 3.2.1 小鼠免疫38
• 3.2.2 多肽包被ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)38-39
• 3.2.3 細(xì)胞壁組分包被ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)39
• 3.2.4 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的分離39
• 3.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T和CD8+T細(xì)胞39
• 3.2.6 小鼠外周血細(xì)胞因子的檢測(cè)39-40
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-45
• 3.3.1 多肽包被ELISA法檢測(cè)抗體水平40-41
• 3.3.2 細(xì)胞壁組分包被ELISA法檢測(cè)抗體水平41-42
• 3.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T和CD8+T細(xì)胞結(jié)果42-43
• 3.3.4 小鼠外周血細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果43-45
• 3.4 討論45-48
• 第四章 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 致謝56-57
• 作者簡(jiǎn)介57

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