本文關(guān)鍵詞：博卡病毒MVC結(jié)構(gòu)蛋白VP2多克隆抗體的制備與鑒定

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【摘要】：目的犬博卡病毒MVC(Minute Virus of canine)是細小病毒家族博卡病毒亞家族的成員之一。而VP2作為MVC病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,不僅是構(gòu)成衣殼蛋白的主要成分,更是細小病毒的主要免疫原性抗原,其具有凝血活性的物質(zhì),是作為決定宿主范圍以及宿主與病毒之間相互作用的關(guān)鍵影響因素。因此,本文通過構(gòu)建MVC的VP2結(jié)構(gòu)蛋白的原核表達載體,通過誘導表達、純化目的蛋白,免疫兔子、制備針對VP2的多克隆抗體,為進一步研究VP2在MVC病毒致病及感染中的作用,深入揭示MVC病毒致病及感染的分子機制奠定研究基礎。方法(1)以本實驗室保存的博卡病毒MVC的感染性克隆載體p IMVC為模板PCR擴增VP2基因,并將其產(chǎn)物純化。將純化產(chǎn)物與表達載體p ET32a(+)經(jīng)EcorⅠ、XhoⅠ同時雙酶切,經(jīng)T4連接酶連接,轉(zhuǎn)化到克隆菌株Ecoli.DH5α以及表達菌株Ecoli.BL21,通過雙酶切鑒定正確后,進行IPTG誘導表達,SDS-PAGE檢測和鑒定目的蛋白的表達。目標蛋白經(jīng)大量表達后,回收細菌超聲裂解并Ni柱純化,以純化產(chǎn)物作為完全抗原免疫新西蘭大白兔。(2)ELISA檢測抗體效價。(3)以MVC感染W(wǎng)RD(Walter Reed Dog)嗜性細胞,然后運用Western blot和免疫熒光技術(shù)鑒定抗體特異性。結(jié)果(1)DNA序列測定及雙酶切鑒定結(jié)果均顯示MVC-VP2基因成功構(gòu)建至原核表達載體p ET32a(+)上,原核表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定后證實成功表達一相對分子量(Mr)約為39kd的目的蛋白條帶,VP2目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。(2)以純化得到的MVC-VP2重組蛋白免疫制備得到兔血清,ELISA方法測得其效價為1:200 000。(3)Western blot、免疫熒光方法證實VP2多抗血清能夠成功檢測MVC感染的WRD細胞,并且具有特性。結(jié)論成功構(gòu)建了MVC結(jié)構(gòu)蛋白基因VP2的原核表達載體p ET32a(+)-VP2,并表達了相應的可溶性蛋白。制備了高效價博卡病毒MVC的VP2多克隆抗體,具有很好的特異性。
【關(guān)鍵詞】：犬博卡病毒 VP2蛋白 原核表達 多克隆抗體
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 中英文縮略詞表8-11
• 前言11-14
• 材料與方法14-28
• 結(jié)果28-35
• 討論35-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-42
• 文獻綜述42-51
• 綜述參考文獻48-51
• 致謝51-52
• 已發(fā)表文章52-53
• 個人簡歷53

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