本文關(guān)鍵詞：HBx-shRNA重組腺病毒的構(gòu)建及功能鑒定

  更多相關(guān)文章： 重組腺病毒 乙型肝炎病毒X蛋白 shRNA 肝細(xì)胞肝癌

【摘要】：目的:構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)標(biāo)簽的乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)特異性shRNA重組腺病毒,并對(duì)其干擾效果進(jìn)行鑒定。方法:將前期構(gòu)建的真核表達(dá)載體pGenesil-1-HBx-shRNA和pGenesil-1-Scramble sequence的表達(dá)啟動(dòng)子U6連同shRNA亞克隆到穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV,構(gòu)建pAdTrack-CMV-U6-HBxshRNA和對(duì)照pAdTrack-CMV-U6-Scramble sequence穿梭質(zhì)粒;酶切及DNA測(cè)序鑒定后,經(jīng)PmeⅠ線性化后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)AdEasier細(xì)菌,獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence,PacⅠ酶切后轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞獲得重組腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA和Ad-U6-Scramble sequence;擴(kuò)增病毒,測(cè)定滴度;以RT-PCR和real-time PCR鑒定重組腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA對(duì)HBx的干擾效果。結(jié)果:酶切鑒定得到陽(yáng)性pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence重組質(zhì)粒;轉(zhuǎn)染到AD293細(xì)胞并包裝成功;RT-PCR以及real-time PCR表明,重組腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA攜帶的干擾片段能夠明顯干擾HBx表達(dá)(P=0.01)。結(jié)論:成功構(gòu)建了HBx特異性shRNA重組腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA,它能抑制HepG2.2.15細(xì)胞中的HBx的表達(dá),為研究HBx作為肝癌基因治療作用的一個(gè)靶點(diǎn)以及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康體檢部;重慶醫(yī)科大學(xué)教育部感染性疾病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： 重組腺病毒 乙型肝炎病毒X蛋白 shRNA 肝細(xì)胞肝癌
【基金】：重慶市渝中區(qū)軟科學(xué)研究資助項(xiàng)目(編號(hào):20110213) 國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科護(hù)理建設(shè)資助項(xiàng)目(編號(hào):財(cái)社【2010】305號(hào))
【分類(lèi)號(hào)】：R373
【正文快照】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染被認(rèn)為是導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要因素之一[1]。HBV X蛋白(hepatitis Bvirus X protein,HBx)是由HBV基因組編碼的17 kD蛋白,大量研究表明HBx與HCC的發(fā)生與發(fā)展有重要的聯(lián)系,因此對(duì)HBx的研究成為治療HCC

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本文編號(hào)：697285