本文關鍵詞：基于流式細胞術的scFv抗體庫篩選技術的建立

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【摘要】：目的利用NlpA前導肽誘導抗體錨定細菌內膜建立篩選scFv抗體庫的展示技術,為高親和力抗體的篩選奠定基礎。方法從pNAD質粒中克隆出NlpA前導肽基因序列,酶切后將該序列克隆進pHEN1表達載體中。以PEAI質粒為模板,利用PCR的方法克隆得到抗-hIL-1β抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因,然后利用重疊PCR的方法構建得到抗-hIL-1βscFv抗體。將scFv抗體插入到NlpA leader-pHEN1表達載體中構建成展示scFv的重組質粒pBSD-scFv。將pBSD-scFv轉入到E.coli DH5α中誘導表達,原生質球制備后,采用梯度濃度的抗原進行孵育,最后經流式細胞術(FCM)檢測抗體展示情況并且分選陽性群體,利用質粒提取的方法來替代PCR方法拯救陽性基因,轉化E.coli DH5α,利用FCM再次檢測該群體展示的抗體與抗原結合情況。結果所展示的抗-hIL-1βscFv抗體依次與抗原和FITC標記的抗原特異性抗體孵育后,用FCM實時檢測,結果顯示出很強的熒光信號并且表現出抗原濃度依賴性。拯救出的pBSD-scFv-原生質球的FCM檢測結果與首次展示的FCM結果一致,該系統(tǒng)能夠穩(wěn)定的展示抗體。結論經過該細菌展示系統(tǒng)展示的scFv抗體能夠有效的折疊,與相應的抗原具有很好的特異結合能力。
【作者單位】： 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所;東北農業(yè)大學生命科學學院生物制藥教研室;
【關鍵詞】： 細菌展示 流式細胞儀篩選 scFv抗體庫
【基金】：哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金(2008RFQXS017) 國家自然科學基金(201031001084;30700591)
【分類號】：R392.11
【正文快照】： 基因工程抗體由于其高專一性、高親和力、高效性和高可塑性被廣泛應用于疾病的臨床診斷、預防、治療及基礎理論研究等領域[1]。目前篩選抗體的方法有噬菌體展示技術、酵母展示技術、核糖體展示技術、細菌展示技術等。與細菌展示技術相比,噬菌體展示技術耗時費力,酵母展示技術

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本文編號：694586