本文關(guān)鍵詞：鉤端螺旋體LA2144基因產(chǎn)物血小板活化因子乙酰水解酶活性的研究

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【摘要】：目的確定問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)LA2144基因產(chǎn)物血小板活化因子乙酰水解酶活性(PAF-AH)、感染細(xì)胞時(shí)表達(dá)與分泌情況,以及誘導(dǎo)金地鼠內(nèi)臟出血的作用。方法采用PCR擴(kuò)增問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株無(wú)信號(hào)肽LA2144基因并構(gòu)建其原核表達(dá)系統(tǒng),采用Ni-NTA親和層析法提純表達(dá)的目的重組蛋白rLep-PAF-AH。采用分光光度法檢測(cè)rLep-PAF-AH水解PAF底物的活性、水解效率及Km和Kcat值。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR (qRT-PCR)和Western Blot法分別檢測(cè)問(wèn)號(hào)鉤體賴株感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、人單核細(xì)胞THP-1和小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1后,LA2144基因mRNA (Lep-PAF-AH-mRNA)水平變化及產(chǎn)物外分泌情況。金地鼠尾靜脈兩次注射100μg無(wú)LPS的rLep-PAF-AH后觀察肺、肝、腎組織中出血情況。結(jié)果所構(gòu)建的問(wèn)號(hào)鉤體賴株LA2144基因原核表達(dá)系統(tǒng)在IPTG誘導(dǎo)下能高效表達(dá)rLep-PAF-AH, Ni-NTA親和層析法提純的rLep-PAF-AH經(jīng)SDS-PAGE后顯示為單一的蛋白條帶。5 μg rLep-PAF-AH對(duì)底物的水解效率為26.6 U/L,其Km和Kcat值分別為82.79 μmol/L和0.24 S-1。問(wèn)號(hào)鉤體賴株與HUVEC、THP-1和J774A.1細(xì)胞共培養(yǎng)1或2 h,Lep-PAF-AH-mRNA水平顯著升高(p0.05)。問(wèn)號(hào)鉤體賴株與上述細(xì)胞共培養(yǎng)2～12 h,培養(yǎng)物上清中檢出大量Lep-PAF-AH,但其EMJH培養(yǎng)物上清中未檢出Lep-PAF-AH。 rLep-PAF-AH注射金地鼠出現(xiàn)肺出血,但肝、腎組織中無(wú)明顯出血現(xiàn)象。結(jié)論LA2144基因產(chǎn)物具有較強(qiáng)PAF-AH活性,感染細(xì)胞時(shí)表達(dá)上調(diào)并外分泌、誘導(dǎo)金地鼠肺出血,故是問(wèn)號(hào)鉤體感染時(shí)引起宿主出血的重要毒力因子。
【關(guān)鍵詞】：問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體/LA2144基因 血小板活化因子乙酰水解酶 基因表達(dá)/蛋白分泌 出血
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R377.5
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-11
• 1 引言11-13
• 2 問(wèn)號(hào)鉤體LA2144基因原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及抗血清制13-36
• 2.1 材料13-18
• 2.2 方法18-33
• 2.3 結(jié)果33-36
• 3 rLep-PAF-AH的PAF-AH酶活性測(cè)定36-41
• 3.1 材料36
• 3.2 方法36-39
• 3.3 結(jié)果39-41
• 4 問(wèn)號(hào)鉤體感染細(xì)胞前后Lep-PAF-AH-mRNA水平變化41-48
• 4.1 材料41-42
• 4.2 方法42-47
• 4.3 結(jié)果47-48
• 5 問(wèn)號(hào)鉤體感染細(xì)胞前后Lep-PAF-AH表達(dá)和分泌檢測(cè)48-52
• 5.1 材料48-49
• 5.2 方法49-50
• 5.3 結(jié)果50-52
• 6 Lep-PAF-AH在宿主內(nèi)臟組織出血中的作用研究52-56
• 6.1 材料52
• 6.2 方法52-54
• 6.3 結(jié)果54-56
• 7 討論56-59
• 8 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 綜述63-74
• 參考文獻(xiàn)69-74
• 作者簡(jiǎn)介及在讀期間所取得的科研成果74

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 鄭林立;葛玉梅;胡瑋琳;嚴(yán)杰;;感染過(guò)程中鉤端螺旋體外膜蛋白抗原表達(dá)水平變化及其調(diào)控機(jī)制[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年02期

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本文編號(hào)：694414