本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌Tipα蛋白經(jīng)激活NLRP3炎性小體誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌IL-1β和IL-18

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【摘要】：目的幽門螺桿菌感染引起的胃部炎癥性變化是產(chǎn)生胃部疾病的主要原因,而幽門螺桿菌Tipα蛋白是新近發(fā)現(xiàn)引起炎癥反應(yīng)的主要致炎蛋白,NLRP3炎性小體是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,本實驗以佛波酯(PMA)誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞為模型,初步探討NLRP3炎性小體在Tipα蛋白誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子分泌中的作用。方法:1.Tipα蛋白的表達與鑒定:Genbank查獲Tipα全基因序列,PCR法獲取去除信號肽后的Tipα基因序列,構(gòu)建p ET-30a(+)/Tipα重組載體;測序鑒定。將p ET-30a(+)/Tipα重組載體轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)表達菌內(nèi),誘導(dǎo)表達、Ni-NTA純化、去內(nèi)毒素處理,Western blot鑒定,BCA法測定Tipα重組蛋白濃度。2.初步探索Tipα蛋白對靶細(xì)胞的致炎作用:用Tipα蛋白刺激巨噬細(xì)胞,ELISA檢測其促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-18的分泌水平。3.驗證Tipα蛋白通過NF-κB/NLRP3信號通路產(chǎn)生炎癥反應(yīng),生成促炎細(xì)胞因子:分別用NF-κB通路阻斷劑PDTC和ROS清除劑NAC預(yù)處理細(xì)胞,ELISA檢測預(yù)處理前后Tipα誘導(dǎo)細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子水平差異,Western blot檢測NLRP3和Caspase-1分子的表達水平差異。結(jié)果:1.雙酶切及測序鑒定p ET-30a(+)/Tipα重組載體插入Tipα基因序列與Genbank登錄序列符合率為100%;載體可在E.coli BL21(DE3)表達菌內(nèi)有效表達一個約25k Da大小的分泌性蛋白,經(jīng)純化后純度達90%以上;Western blot鑒定Tipα可與His標(biāo)簽抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)。2.一定濃度的Tipα蛋白可顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-18;Tipα蛋白濃度為40μg/ml時,刺激細(xì)胞6h后,TNF-α、IL-18和IL-1β表達水平接近峰值(P0.05)。3.特異性阻斷NF-κB信號通路后,ELISA結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子較阻斷前明顯降低,Western blot結(jié)果顯示Caspase-1和NLRP3分子的表達水平較阻斷前均有明顯降低。4.ROS清除劑NAC預(yù)處理細(xì)胞后,ELISA結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞分泌的IL-18和IL-1β較處理前有明顯降低,TNF-α沒有明顯變化(P0.05);Western blot結(jié)果顯示Caspase-1和NLRP3分子的表達水平較阻斷前均有明顯降低。結(jié)論:1.Tipα能促進巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-18。2.NLRP3/Caspase-1途徑可能參與了Tipα誘導(dǎo)的IL-1β和IL-18分泌。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 Tipα 細(xì)胞因子 NLRP3炎性小體
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 常用英文縮寫10-16
• 第1章 前言16-20
• 第2章 實驗材料20-24
• 1 主要實驗儀器20-21
• 2 載體、菌株及細(xì)胞株21
• 3 主要實驗試劑21-24
• 3.1 主要試劑盒21
• 3.2 主要實驗試劑21-22
• 3.3 培養(yǎng)基及溶液22
• 3.4 其他22-24
• 第3章 實驗方法24-38
• 1 目的基因Tipα的擴增24-26
• 1.1 H. pylori26695標(biāo)準(zhǔn)株的培養(yǎng)與其全基因組DNA模板的提取24
• 1.2 目的基因Tipα的引物的設(shè)計與合成24-25
• 1.3 PCR擴增目的基因Tipα25
• 1.4 純化目的基因PCR產(chǎn)物25-26
• 2 構(gòu)建Tipα原核表達載體26-29
• 2.1 p ET-30 a (+)質(zhì)粒的擴增與純化26
• 2.2 目的基因Tipα和p ET-30 a (+)質(zhì)粒的雙酶切26-27
• 2.3 目的基因Tipα和p ET-30a(+)質(zhì)粒的連接27
• 2.4 制備感受態(tài)細(xì)菌27-28
• 2.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化28
• 2.6 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定28-29
• 3 Tipα重組蛋白的表達、鑒定和純化29-34
• 3.1 Tipα重組蛋白的誘導(dǎo)表達29-31
• 3.2 Tipα重組蛋白的Western Blot鑒定31-32
• 3.3 Tipα重組蛋白的大規(guī)模誘導(dǎo)表達和純化32-33
• 3.4 Tipα重組蛋白去內(nèi)毒素33
• 3.5 蛋白濃度的測定33-34
• 4 THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)和模型建立34
• 4.1 THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)34
• 4.2 THP-1 細(xì)胞誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞的模型建立34
• 5 ELISA檢測促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-18 和IL-1β水平34-35
• 5.1 TNF-α的檢測34-35
• 5.2 IL-18 的檢測35
• 5.3 IL-1β的檢測35
• 6 ELISA檢測阻斷信號通路后對各促炎細(xì)胞因子表達的影響35
• 7 Western Blot檢測阻斷信號通路前后NLRP3、Caspase-1 的表達變化35-38
• 7.1 已刺激巨噬細(xì)胞的收集和處理35-36
• 7.2 Western Blot檢測36-38
• 第4章 實驗結(jié)果38-52
• 1 Tipα重組蛋白的誘導(dǎo)表達與鑒定38-47
• 1.1 Tipα基因的PCR擴增結(jié)果38
• 1.2 重組質(zhì)粒p ET30a(+)/Tipα的菌液PCR鑒定38-39
• 1.3 重組質(zhì)粒p ET30a(+)/Tipα的雙酶切鑒定39-40
• 1.4 基因比對分析40-41
• 1.5 Tipα/p ET30a(+)重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達和鑒定41-45
• 1.6 Tipα重組蛋白的純化45-46
• 1.7 Tipα重組蛋白的濃度測定46
• 1.8 Tipα重組蛋白的鑒定46-47
• 2 Tipα刺激對THP-1 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響47-48
• 3 PDTC對Tipα誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子以及表達Caspase-1 和NLRP3的影響48-50
• 4 NAC對促炎細(xì)胞因子的分泌及Caspase-1 和NLRP3的表達的影響50-52
• 第5章 討論52-56
• 第6章 結(jié)論56-58
• 參考文獻58-62
• 文獻綜述62-70
• 參考文獻67-70
• 附錄70-74
• 發(fā)表的論文與參與課題74-76
• 致謝76

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