發(fā)布時(shí)間：2017-08-16 08:27

  本文關(guān)鍵詞：mICAM-1在MSCs和EPCs間黏附作用的研究

  更多相關(guān)文章： 間充質(zhì)干細(xì)胞 內(nèi)皮祖細(xì)胞 細(xì)胞間黏附分子-1 IL-1β P38MAPK通路

【摘要】：目的探討細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)在間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和血管內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPCs)間黏附作用及其機(jī)制的研究。方法1.分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增來源于6-8周齡的C57BL/6小鼠骨髓的MSCs和EPCs;2.Elisa方法檢測MSCs,EPCs,MSCsEPCs,EPCs-CM-MSCs和MSCs-CM-EPCs條件培養(yǎng)基(-CM)中IL-1β的表達(dá)水平;3.細(xì)胞免疫熒光檢測ICAM-1在正常組、IL-1β刺激組、P38MAPK通路抑制劑SB203580刺激組中MSCs組、EPCs組、MSCs+EPCs共培養(yǎng)組(MSCEPC)ICAM-1的表達(dá)情況;4.通過Western blot技術(shù)檢測ICAM-1在正常組、IL-1β刺激組、P38MAPK通路抑制劑SB203580組中ICAM-1蛋白和P38MAPK通路蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測;5.通過添加相應(yīng)濃度抗ICAM-1中和抗體、IL-1β、SB203580,在基質(zhì)膠上觀察MSCs和EPCs間黏附的變化。結(jié)果1.通過Elisa方法檢測MSCs,EPCs,MSCsEPCs,EPCs-CM-MSCs和MSCs-CM-EPCs中IL-1β的表達(dá)水平。所有的細(xì)胞均以同樣的密度種植,且使用無血清、無生長因子的無菌PBS培養(yǎng),誘導(dǎo)時(shí)間均為24 h。結(jié)果顯示,MSCs組(8.96±2.70 ng/ml,*P0.05)和EPCs組(22.14±1.83 ng/ml,*P0.05)均可分泌IL-1β,但MSCsEPCs組(49.13±6.21ng/ml)分泌量明顯高于MSCs組和EPCs組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EPCs-CM-MSCs組(35.02±1.19 ng/ml)和MSCs-CM-EPCs組(33.85±1.37 ng/ml)IL-1β的分泌量明顯高于MSCs組(8.96±2.70 ng/ml,*P0.05)和EPCs組(22.14±1.83 ng/ml,*P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但并不高于MSCsEPCs組(49.13±6.21 ng/ml,P0.05)。2.通過細(xì)胞免疫熒光檢測IL-1β誘導(dǎo)組、正常組及P38MAPK通路抑制劑組ICAM-1的表達(dá)水平。每個細(xì)胞玻片以相同的細(xì)胞密度于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。然后使用無血清及生長因子的培養(yǎng)基替代,加入IL-1β(25μg/ml)及P38MAPK通路抑制劑SB203580(20μmol/ml)誘導(dǎo)24 h,正常組不添加任何藥物處理。結(jié)果顯示MSCs和EPCs均低表達(dá)ICAM-1,且MSCsEPCs促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)。IL-1β促進(jìn)MSCs、EPCs及MSCsEPCs ICAM-1的表達(dá),P38MAPK通路抑制劑SB203580下調(diào)MSCs、EPCs及MSCsEPCs ICAM-1的表達(dá)。IL-1β誘導(dǎo)組ICAM-1表達(dá)高于正常組和P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組的相應(yīng)各組,且P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組的相應(yīng)各組ICAM-1表達(dá)較正常組下調(diào)。3.通過Western blot檢測ICAM-1及P38MAPK蛋白的表達(dá)水平。MSCs,EPCs和MSCsEPCs組均表達(dá)ICAM-1和P38MAPK通路蛋白,結(jié)果以ICAM-1/GAPDH IOD平均水平和p-P38MAPK/total-P38MAPK IOD平均水平表示。結(jié)果顯示正常組MSCsEPCs組(0.21±0.01,*P0.05)ICAM-1蛋白的表達(dá)量較正常組MSCs組(0.11±0.02,*P0.05)和EPCs組(0.11±0.02,*P0.05)高。IL-1β誘導(dǎo)組MSCsEPCs組(0.38±0.02,*P0.05)ICAM-1蛋白的表達(dá)量較同組內(nèi)MSCs組(0.23±0.02,*P0.05)和EPCs組(0.25±0.02,*P0.05)高。P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組MSCsEPCs組(0.10±0.02,*P0.05)ICAM-1蛋白的表達(dá)量較同組內(nèi)MSCs組(0.05±0.01,*P0.05)和EPCs組(0.05±0.01,*P0.05)高。IL-1β誘導(dǎo)組的MSCs組、EPCs組及MSCsEPCs組ICAM-1蛋白的表達(dá)量均高于相應(yīng)的正常組和P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組。正常組的MSCs組、EPCs組及MSCsEPCs組ICAM-1蛋白的表達(dá)量均高于相應(yīng)的P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組。正常組MSCsEPCs組(0.52±0.02,*P0.05)p-P38MAPK通路蛋白的表達(dá)量較正常組MSCs組(0.35±0.02,*P0.05)和EPCs組(0.36±0.01,*P0.05)高。IL-1β誘導(dǎo)組MSCsEPCs組(0.74±0.06,*P0.05)p-P38MAPK通路蛋白的表達(dá)量較同組內(nèi)MSCs組(0.54±0.04,*P0.05)和EPCs組(0.47±0.03,*P0.05)高。P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組MSCsEPCs組(0.37±0.02,*P0.05)p-P38MAPK通路蛋白的表達(dá)量較同組內(nèi)MSCs組(0.26±0.03,*P0.05)和EPCs組(0.17±0.01,*P0.05)高。IL-1β誘導(dǎo)組的MSCs組、EPCs組及MSCsEPCs組p-P38MAPK通路蛋白表達(dá)量均高于正常組和P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組。正常組的MSCs組、EPCs組及MSCsEPCs組p-P38MAPK通路蛋白表達(dá)量均高于相應(yīng)的P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組。各組total-P38MAPK通路蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。4.MSCs和EPCs間的黏附實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中我們以DAPI標(biāo)記MSCs,以Mitotracker red標(biāo)記EPCs。將標(biāo)記后的MSCs和EPCs細(xì)胞在鋪有基質(zhì)膠的24孔板上進(jìn)行共培養(yǎng),同時(shí)依次添加抗ICAM-1中和抗體、IL-1β和P38MAPK通路抑制劑SB203580,正常組不做處理。結(jié)果顯示加入抗ICAM-1中和抗體和P38MAPK通路抑制劑SB203580組中MSCs和EPCs的黏附較正常組降低,而添加IL-1β誘導(dǎo)組MSCs和EPCs的黏附較正常組增多。結(jié)論1.利用全骨髓貼壁法結(jié)合差時(shí)貼壁法可有效分離和擴(kuò)增MSCs和EPCs細(xì)胞。2.ICAM-1參與介導(dǎo)MSCs和EPCs間的黏附過程。3.IL-1β促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)增高以增強(qiáng)MSCs和EPCs間的黏附通過P38MAPK通路;4.MSCs和EPCs黏附通過直接和間接分泌的方式共同調(diào)節(jié)IL-1β的分泌。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 內(nèi)皮祖細(xì)胞 細(xì)胞間黏附分子-1 IL-1β P38MAPK通路
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-13
• 英文縮略語表13-14
• 前言14-15
• 第一部分：C57BL/6 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、擴(kuò)增及培養(yǎng)15-19
• 實(shí)驗(yàn)一：C57BL/6 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及血管內(nèi)皮前體細(xì)胞的分離、擴(kuò)增及培養(yǎng)15-19
• 1 材料15-16
• 1.1 主要儀器和試劑15-16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動物16
• 1.3 主要溶液的配制16
• 2 方法16-17
• 2.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）的分離和培養(yǎng)16-17
• 2.2 小鼠血管內(nèi)皮前體細(xì)胞（EPCs）的分離和培養(yǎng)17
• 3 結(jié)果17-18
• 3.1 MSCs及EPCs的形態(tài)學(xué)特征17-18
• 4 討論18-19
• 第二部分：細(xì)胞間黏附分子 1（ICAM-1）在間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）和血管內(nèi)皮前體細(xì)胞（EPCs）間黏附作用的研究19-34
• 實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞間黏附分子 1（ICAM-1）在間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）和血管內(nèi)皮前體細(xì)胞（EPCs）間黏附作用的研究19-34
• 1 材料19-20
• 1.1 主要儀器和試劑19-20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動物20
• 2 方法20-29
• 2.1 細(xì)胞免疫熒光檢測MSCs、EPCs及MSCs&EPCs組中ICAM-1 表達(dá)20-21
• 2.2 實(shí)時(shí)定量PCR（ RT-PCR）檢測MSCs、EPCs及MSCs&EPCs組中ICAM-1m RNA表達(dá)水平21-23
• 2.2.1 細(xì)胞準(zhǔn)備及總RNA提取21-22
• 2.2.2 反轉(zhuǎn)錄22
• 2.2.3 熒光定量PCR檢測22-23
• 2.3 Western blotting檢測MSCs、EPCs及MSCs&EPCs組中ICAM-1 蛋白表達(dá)水平23-27
• 2.3.1 細(xì)胞準(zhǔn)備23
• 2.3.2 細(xì)胞總蛋白的提取23-24
• 2.3.3 Western blot相關(guān)試劑的配制24-26
• 2.3.4 凝膠的配制26
• 2.3.5 凝膠電泳26-27
• 2.3.6 轉(zhuǎn)印蛋白及免疫檢測27
• 2.4 MSCs和EPCs的黏附實(shí)驗(yàn)27-29
• 2.4.1 細(xì)胞準(zhǔn)備27-28
• 2.4.2 Mitotracker red的配制28
• 2.4.3 DAPI標(biāo)記MSCs28
• 2.4.4 Mitotracker red標(biāo)記EPCs28
• 2.4.5 黏附實(shí)驗(yàn)28-29
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法29
• 3 結(jié)果29-32
• 3.1 細(xì)胞免疫熒光及熒光半定量檢測ICAM-1 表達(dá)水平29-30
• 3.2 RT-PCR檢測ICAM-1 m RNA表達(dá)水平30
• 3.3 Western blot檢測ICAM-1 蛋白表達(dá)水平30-31
• 3.4 抗ICAM-1 抗體對MSCs和EPCs間黏附作用的影響31-32
• 4 討論32-34
• 第三部分：白細(xì)胞介素 1（IL-1）誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子 1（ICAM-1）表達(dá)增強(qiáng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）和血管內(nèi)皮前體細(xì)胞（EPCs）間黏附作用通過P38MAPK通路的研究34-44
• 實(shí)驗(yàn)一：白細(xì)胞介素 1（IL-1）誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子 1（ICAM-1）表達(dá)增強(qiáng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）和血管內(nèi)皮前體細(xì)胞（EPCs）間黏附作用通過P38MAPK通路的研究34-44
• 1 材料34-35
• 1.1 主要儀器和試劑34
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動物34
• 1.3 主要溶液的配制34-35
• 2 方法35-37
• 2.1 條件培養(yǎng)基的提取35
• 2.2 Elisa檢測條件培養(yǎng)基中IL-1β 的表達(dá)水平35-37
• 2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測IL-1β 誘導(dǎo)組、正常組及P38MAPK通路抑制劑組ICAM-1 的表達(dá)水平37
• 2.3.1 細(xì)胞準(zhǔn)備37
• 2.3.2 細(xì)胞免疫熒光檢測IL-1β 誘導(dǎo)組、正常組及P38MAPK通路抑制劑組ICAM-1 的表達(dá)水平37
• 2.4 Western blot檢測IL-1β 誘導(dǎo)組、正常組及P38MAPK通路抑制劑組ICAM-1的表達(dá)水平37
• 2.5 黏附實(shí)驗(yàn)37
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法37
• 3 結(jié)果37-42
• 3.1 Elisa檢測條件培養(yǎng)基中IL-1β 的表達(dá)水平37-38
• 3.2 細(xì)胞免疫熒光檢測IL-1β 誘導(dǎo)組、正常組及P38MAPK通路抑制劑組ICAM-1 的表達(dá)水平38-40
• 3.3 Western blot檢測ICAM-1 及P38MAPK蛋白的表達(dá)水平40-42
• 3.4 MSCs和EPCs間的黏附實(shí)驗(yàn)42
• 4 討論42-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 綜述50-65
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 致謝65-66
• 作者簡介66-67
• 石河子大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文導(dǎo)師評閱表67

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本文編號：682268