本文關鍵詞：類鼻疽菌重要毒素分子BLF1的重組表達及生物學活性研究

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【摘要】：類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei,簡稱類鼻疽菌)是一種革蘭陰性桿菌,主要存在于水或土壤中,可經(jīng)由呼吸道吸入、消化道攝入、皮膚侵入等方式進行傳播,主要侵犯人體肺部,可引起以肺炎、肺部空洞及肺部膿腫為特點的類鼻疽病,還可導致皮膚、腎臟、肝臟等多器官膿腫,嚴重者還可能發(fā)展為急性敗血癥而導致死亡。類鼻疽作為一種新發(fā)現(xiàn)傳染病,診斷困難、致病性強、臨床用藥治療困難,并且潛伏期較長,流行地區(qū)死亡率高達40%;其流行區(qū)域主要分布在南、北緯二十度內,涵蓋新加坡、澳大利亞、越南、柬埔寨、馬來西亞、老撾、泰國東北部等地區(qū)以及我國香港、臺灣、廣東、海南等地區(qū),越來越多的證據(jù)表明它是一種正在全球擴散的人獸共患傳染病,目前尚無批準使用的有效類鼻疽疫苗,因此亟待加強類鼻疽的相關研究。毒力因子在細菌致病過程中發(fā)揮重要作用,類鼻疽菌的毒力因子主要有III型分泌系統(tǒng)、VI型分泌系統(tǒng)、莢膜多糖、鞭毛、菌毛、群體感應分子、脂多糖等。2011年被發(fā)現(xiàn)的類鼻疽伯克霍爾德菌致死因子1(Burkholderia lethal factor 1,BLF1),由bpsl1549基因編碼,結構類似于大腸桿菌的細胞毒力因子CNF1-C,主要通過抑制e IF4A解旋酶的活性干擾蛋白質的翻譯起始階段,引起肌動蛋白細胞骨架的改變,并最終導致宿主細胞死亡。類鼻疽的死亡率較高,而BLF1作為類鼻疽菌第一個被發(fā)現(xiàn)的致死因子,其重要性不言而喻,獲取該毒素對研究其致病機制以及指導類鼻疽的診斷和防治具有重要意義。近年來,隨著蛋白合成抑制劑在抗腫瘤治療方面的效果逐漸被認可,人們對蛋白質翻譯起始因子e IF4A的抑制劑在靶向抗腫瘤治療中應用的關注度也越來越高。BLF1作為潛在的eIF4A解旋酶活性抑制劑,能夠抑制蛋白質的合成。那么我們可以設想,如果將該毒素遞送至腫瘤細胞后,毒素是否具有廣譜殺傷腫瘤細胞的作用呢?目前國內外尚無相關的研究報道。本研究的主要目的是通過基因工程技術重組表達BLF1(rBLF1)蛋白,并初步研究BLF1對腫瘤細胞的殺傷作用,為該蛋白在抗腫瘤治療中的應用提供依據(jù)。方法:1.以BPC006菌株的全基因組DNA為模板,PCR擴增bpsl1549基因,目的基因與pGEX-6P-2載體質粒同時進行BamHI/Xho I雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)回收、連接后轉化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞,氨芐抗性LB平板篩選陽性克隆,雙酶切及DNA測序驗證。2.IPTG誘導陽性重組子表達GST-BLF1融合蛋白,親和層析純化融合蛋白并經(jīng)PSP酶酶切后獲得rBLF1蛋白。以純化rBLF1蛋白免疫新西蘭兔,制備抗BLF1血清,并通過Western blot及ELISA法鑒定。3.A549細胞模型中,通過CCK-8實驗研究目的蛋白的細胞毒性效應及抗體阻斷作用。不同濃度r BLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,觀察小鼠生存率。結果:1.從類鼻疽菌基因組DNA中PCR得到了編碼BLF1的目的基因,并通過p GEX-6P-2載體成功構建了高效表達BLF1的工程菌株。2.經(jīng)過二步親和層析得到了分子量為23kD的高純度r BLF1,將純化蛋白免疫新西蘭兔制備抗血清,ELISA效價達1:1 280000,Western blot鑒定在目的蛋白位置處出現(xiàn)特異印跡條帶。3.rBLF1蛋白能明顯殺傷A549細胞,抗體可有效阻斷其殺傷作用。4.rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,小鼠死亡率隨蛋白劑量的增加而升高,同時正常小鼠對低劑量BLF1表現(xiàn)出一定的耐受性。結論:重組表達了具有生物活性的rBLF1,該蛋白具有明顯殺傷A549腫瘤細胞的作用,同時能夠導致小鼠死亡,但表現(xiàn)出一定耐受性。以上結果為進一步研究類鼻疽菌的致病機制、尋找有效防治手段以及開發(fā)該毒素在抗腫瘤中的應用奠定了基礎。
【關鍵詞】：類鼻疽菌 毒力因子 細胞毒性
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 英文摘要7-9
• 中文摘要9-11
• 1. 前言11-14
• 2. 實驗材料14-20
• 3. 實驗方法20-33
• 4. 實驗結果33-42
• 5. 討論42-44
• 全文總結44-45
• 參考文獻45-49
• 文獻綜述 類鼻疽菌重要毒力因子Hcp149-58
• 參考文獻55-58
• 附錄58-61
• 攻讀碩士學位期間取得的主要成果61-62
• 致謝62

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