發(fā)布時(shí)間：2017-08-13 10:17

  本文關(guān)鍵詞：類鼻疽菌重要毒素分子BLF1的重組表達(dá)及生物學(xué)活性研究

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【摘要】：類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei,簡(jiǎn)稱類鼻疽菌)是一種革蘭陰性桿菌,主要存在于水或土壤中,可經(jīng)由呼吸道吸入、消化道攝入、皮膚侵入等方式進(jìn)行傳播,主要侵犯人體肺部,可引起以肺炎、肺部空洞及肺部膿腫為特點(diǎn)的類鼻疽病,還可導(dǎo)致皮膚、腎臟、肝臟等多器官膿腫,嚴(yán)重者還可能發(fā)展為急性敗血癥而導(dǎo)致死亡。類鼻疽作為一種新發(fā)現(xiàn)傳染病,診斷困難、致病性強(qiáng)、臨床用藥治療困難,并且潛伏期較長(zhǎng),流行地區(qū)死亡率高達(dá)40%;其流行區(qū)域主要分布在南、北緯二十度內(nèi),涵蓋新加坡、澳大利亞、越南、柬埔寨、馬來西亞、老撾、泰國(guó)東北部等地區(qū)以及我國(guó)香港、臺(tái)灣、廣東、海南等地區(qū),越來越多的證據(jù)表明它是一種正在全球擴(kuò)散的人獸共患傳染病,目前尚無批準(zhǔn)使用的有效類鼻疽疫苗,因此亟待加強(qiáng)類鼻疽的相關(guān)研究。毒力因子在細(xì)菌致病過程中發(fā)揮重要作用,類鼻疽菌的毒力因子主要有III型分泌系統(tǒng)、VI型分泌系統(tǒng)、莢膜多糖、鞭毛、菌毛、群體感應(yīng)分子、脂多糖等。2011年被發(fā)現(xiàn)的類鼻疽伯克霍爾德菌致死因子1(Burkholderia lethal factor 1,BLF1),由bpsl1549基因編碼,結(jié)構(gòu)類似于大腸桿菌的細(xì)胞毒力因子CNF1-C,主要通過抑制e IF4A解旋酶的活性干擾蛋白質(zhì)的翻譯起始階段,引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改變,并最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。類鼻疽的死亡率較高,而BLF1作為類鼻疽菌第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的致死因子,其重要性不言而喻,獲取該毒素對(duì)研究其致病機(jī)制以及指導(dǎo)類鼻疽的診斷和防治具有重要意義。近年來,隨著蛋白合成抑制劑在抗腫瘤治療方面的效果逐漸被認(rèn)可,人們對(duì)蛋白質(zhì)翻譯起始因子e IF4A的抑制劑在靶向抗腫瘤治療中應(yīng)用的關(guān)注度也越來越高。BLF1作為潛在的eIF4A解旋酶活性抑制劑,能夠抑制蛋白質(zhì)的合成。那么我們可以設(shè)想,如果將該毒素遞送至腫瘤細(xì)胞后,毒素是否具有廣譜殺傷腫瘤細(xì)胞的作用呢?目前國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)的研究報(bào)道。本研究的主要目的是通過基因工程技術(shù)重組表達(dá)BLF1(rBLF1)蛋白,并初步研究BLF1對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,為該蛋白在抗腫瘤治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。方法:1.以BPC006菌株的全基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增bpsl1549基因,目的基因與pGEX-6P-2載體質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行BamHI/Xho I雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)回收、連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞,氨芐抗性LB平板篩選陽性克隆,雙酶切及DNA測(cè)序驗(yàn)證。2.IPTG誘導(dǎo)陽性重組子表達(dá)GST-BLF1融合蛋白,親和層析純化融合蛋白并經(jīng)PSP酶酶切后獲得rBLF1蛋白。以純化rBLF1蛋白免疫新西蘭兔,制備抗BLF1血清,并通過Western blot及ELISA法鑒定。3.A549細(xì)胞模型中,通過CCK-8實(shí)驗(yàn)研究目的蛋白的細(xì)胞毒性效應(yīng)及抗體阻斷作用。不同濃度r BLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,觀察小鼠生存率。結(jié)果:1.從類鼻疽菌基因組DNA中PCR得到了編碼BLF1的目的基因,并通過p GEX-6P-2載體成功構(gòu)建了高效表達(dá)BLF1的工程菌株。2.經(jīng)過二步親和層析得到了分子量為23kD的高純度r BLF1,將純化蛋白免疫新西蘭兔制備抗血清,ELISA效價(jià)達(dá)1:1 280000,Western blot鑒定在目的蛋白位置處出現(xiàn)特異印跡條帶。3.rBLF1蛋白能明顯殺傷A549細(xì)胞,抗體可有效阻斷其殺傷作用。4.rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,小鼠死亡率隨蛋白劑量的增加而升高,同時(shí)正常小鼠對(duì)低劑量BLF1表現(xiàn)出一定的耐受性。結(jié)論:重組表達(dá)了具有生物活性的rBLF1,該蛋白具有明顯殺傷A549腫瘤細(xì)胞的作用,同時(shí)能夠?qū)е滦∈笏劳?但表現(xiàn)出一定耐受性。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究類鼻疽菌的致病機(jī)制、尋找有效防治手段以及開發(fā)該毒素在抗腫瘤中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：類鼻疽菌 毒力因子 細(xì)胞毒性
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 英文摘要7-9
• 中文摘要9-11
• 1. 前言11-14
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料14-20
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法20-33
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-42
• 5. 討論42-44
• 全文總結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 文獻(xiàn)綜述 類鼻疽菌重要毒力因子Hcp149-58
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 附錄58-61
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的主要成果61-62
• 致謝62

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本文編號(hào)：666767