本文關(guān)鍵詞：以斑馬魚為模式動物發(fā)現(xiàn)椎間盤重度受損引起椎骨退變

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【摘要】：頸椎病是困擾口腔醫(yī)生的一種常見慢性疾病。研究表明,頸椎病發(fā)生的主要原因是以椎間盤退變?yōu)榛A(chǔ)的頸椎退行性變。椎間盤退變構(gòu)成大多數(shù)脊椎肌肉骨骼疾病的病理基礎(chǔ),包括退行性椎管狹窄,椎間不穩(wěn),頸椎綜合征等。骨質(zhì)疏松與椎間盤退變存在一定的相關(guān)性,骨質(zhì)疏松會引發(fā)甚至加重椎間盤退變。但是椎間盤與椎骨的發(fā)生發(fā)育、退變和再生修復(fù)是一個復(fù)雜過程,確切分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。因此,對于椎間盤與椎骨的退變機(jī)制與自我修復(fù)機(jī)理的深入研究可為椎間盤退行性疾病與椎骨退變的預(yù)防和治療提供理論指導(dǎo)。目的:利用斑馬魚這類新型模式動物來構(gòu)建椎間盤損傷模型,探討椎間盤重度損傷模型應(yīng)用于椎間盤退行性疾病的研究,為深入探究椎間盤退變與椎骨退變的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:本研究通過分子克隆的生物學(xué)技術(shù)手段構(gòu)建重組質(zhì)粒p Bluescript II-KS-twhh-Dendra2-NTR,借助顯微注射的方式將0.15ng經(jīng)純化過的重組質(zhì)粒注射到單細(xì)胞期的胚胎的動物極,經(jīng)過三代連續(xù)傳代,我們培養(yǎng)出穩(wěn)定的斑馬魚Tg(twhh:Dendra2-NTR)轉(zhuǎn)基因魚系。利用Mtz/NTR系統(tǒng)對斑馬魚椎間盤的重度損傷來模擬椎間盤退變,組織切片HE染色觀察椎間盤與椎骨組織形態(tài)學(xué)的改變、TUNEL實(shí)驗揭示椎間盤細(xì)胞凋亡的特點(diǎn),Micro CT掃描來評估椎體骨組織的微觀結(jié)構(gòu)差異、原位雜交檢測椎體中成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果:通過分子克隆的生物學(xué)技術(shù)手段成功構(gòu)建重組質(zhì)粒p Bluescript II-KS-twhh-Dendra2-NTR。利用顯微注射的方式培育出穩(wěn)定的斑馬魚Tg(twhh:Dendra2-NTR)轉(zhuǎn)基因魚系。借助激光共聚焦顯微鏡掃描Tg(twhh:Dendra2-NTR)轉(zhuǎn)基因魚揭示斑馬魚椎間盤發(fā)育過程:在幼魚早期綠色熒光細(xì)胞標(biāo)記脊索細(xì)胞和底板細(xì)胞,茜素紅染色的紅色椎骨礦化是呈環(huán)形椎體的形式,從脊索的頭部向尾部逐漸發(fā)育的;在斑馬魚青年期綠色熒光細(xì)胞標(biāo)記椎間盤內(nèi)的纖維環(huán)和髓核細(xì)胞,茜素紅染色的紅色椎骨礦化開始向前后端和背腹側(cè)擴(kuò)展,每個礦化的脊椎由椎體,神經(jīng)弓,血管弓三個部分組成,神經(jīng)弓和血管弓都處于椎骨體的前側(cè)邊緣;在斑馬魚成年期綠色熒光細(xì)胞特異性的標(biāo)記椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞,茜素紅染色的紅色椎骨發(fā)育完全成熟,將綠色標(biāo)記的椎間盤鑲嵌在其內(nèi)部,脊柱呈現(xiàn)明顯分段模式。利用激光共聚焦顯微鏡掃描顯示重度損傷的椎間盤綠色熒光細(xì)胞無法自我修復(fù),茜素紅染色的紅色椎骨緊密相連、礦化障礙等椎骨退變的病理表型。脊柱組織切片的HE染色揭示椎間盤與椎骨組織的細(xì)胞形態(tài)方面的退變;椎間盤的細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯退變,椎骨的礦化受阻。TUNEL實(shí)驗證實(shí)處理組中只有椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞發(fā)生大量細(xì)胞凋亡,這與椎間盤退行性疾病中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多的主要特點(diǎn)是一致的。Micro CT掃描揭示椎骨融合,體積變小,礦化異常等椎骨退變表型。脊柱的原位雜交技術(shù)檢測證實(shí)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)均出現(xiàn)一定程度的下調(diào)。·結(jié)論:斑馬魚椎間盤重度損傷模型可用于椎間盤退變的研究。重度損傷的椎間盤發(fā)生退變進(jìn)而引起椎骨退行性病變。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚 椎間盤損傷 椎骨退變 動物模型 Mtz/NTR系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R681.5
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-17
• 第一部分 Tg(twhh:Dendra2-NTR)斑馬魚轉(zhuǎn)基因系的構(gòu)建17-34
• 實(shí)驗一 pBluescript II-KS-twhh-Dendra2-NTR重組質(zhì)粒構(gòu)建17-28
• 1 實(shí)驗材料17-19
• 2 實(shí)驗方法19-24
• 3 實(shí)驗結(jié)果24-28
• 實(shí)驗二 斑馬魚轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)的構(gòu)建28-34
• 1 實(shí)驗材料28-29
• 2 實(shí)驗方法29-31
• 3 實(shí)驗結(jié)果31-34
• 第二部分 椎間盤重度受損引起椎骨退變34-47
• 實(shí)驗一 轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)重度損傷模型構(gòu)建34-36
• 1 實(shí)驗材料34-35
• 2 實(shí)驗方法35
• 3 實(shí)驗結(jié)果35-36
• 實(shí)驗二 斑馬魚椎間盤重度損傷后脊柱的Micro CT掃描分析36-38
• 1 實(shí)驗材料36-37
• 2 實(shí)驗方法37
• 3 實(shí)驗結(jié)果37-38
• 實(shí)驗三 斑馬魚椎間盤重度損傷后脊柱的組織形態(tài)學(xué)分析38-41
• 1 實(shí)驗材料38-39
• 2 實(shí)驗方法39-40
• 3 實(shí)驗結(jié)果40-41
• 實(shí)驗四 斑馬魚椎間盤重度損傷后椎間盤的TUNEL實(shí)驗分析41-44
• 1 實(shí)驗材料41
• 2 實(shí)驗方法41-42
• 3 實(shí)驗結(jié)果42-44
• 實(shí)驗五 斑馬魚椎間盤重度損傷后脊柱osterix與ctsk基因的原位雜交分析44-47
• 1 實(shí)驗材料44
• 2 實(shí)驗方法44-45
• 3 實(shí)驗結(jié)果45-47
• 討論47-51
• 全文總結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 文獻(xiàn)綜述56-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 致謝63-65
• 碩士期間發(fā)表的論文65

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 黃玉婷;李上;張家花;張夢茹;張珂;;口腔科醫(yī)生頸椎病調(diào)查[J];中國誤診學(xué)雜志;2010年34期

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3 董研,王美青;咬合與頸椎功能紊亂相關(guān)性的研究進(jìn)展[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2003年05期

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本文編號：665656