本文關(guān)鍵詞：Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗毒種的遺傳穩(wěn)定性研究及Sabin株病毒深度測(cè)序方法的探索

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【摘要】：脊髓灰質(zhì)炎(Poliomyelitis,以下簡(jiǎn)稱脊灰)是由脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliomyelitis Virus, PV)感染引起、危害極大的急性傳染病,尚無(wú)有效治療方法,只能通過(guò)疫苗預(yù)防。口服脊灰減毒活疫苗(Oral Poliomyelitis Vaccine, OPV)因接種方便,成本相對(duì)較低而一度被廣泛使用,但可能引起脊灰疫苗相關(guān)麻痹病例(Vaccine-Associated Paralytic Poliomyelitis, VAPP)和疫苗衍生株脊灰病毒(Vaccine-Derived Poliovirus, VDPV)病例,滅活脊灰疫苗(Inactivated poliomyelitis vaccine, IPV)能有效避免VAPP和VDPV,采用IPV取代OPV是《全球消滅脊灰戰(zhàn)略終結(jié)計(jì)劃》的要求。而在全世界消滅脊灰后,采用野毒株(Salk)生產(chǎn)IPV對(duì)生物安全水平要求更加嚴(yán)格,因此WHO鼓勵(lì)疫苗廠家研發(fā)Sabin株脊灰滅活疫苗(Inactivated Poliomyelitis Vaccine, Sabin strain, sIPV)o在研發(fā)sIPV過(guò)程中,Sabin株毒種的遺傳穩(wěn)定性極其重要。本研究通過(guò)檢測(cè)PV感染性滴度、D抗原含量以及PV全基因組Sanger測(cè)序的方法來(lái)檢測(cè)制備的工作種子和疫苗代次病毒的遺傳穩(wěn)定性。此外,生產(chǎn)中在對(duì)疫苗質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí),需區(qū)別通過(guò)和未通過(guò)猴體神經(jīng)毒力試驗(yàn)(Monkeys Neurovirulence Test, MNVT)的疫苗之間的差別；而采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)作突變分析(Mutant Analysis by PCR and Restriction Enzyme Cleavage, MAPREC)雖然可以準(zhǔn)確地測(cè)定出一個(gè)堿基位點(diǎn)突變的量,但無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組每個(gè)核苷酸的序列變化都進(jìn)行監(jiān)測(cè)。隨著分子水平的基因檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)不斷發(fā)展和完善,第二代測(cè)序技術(shù)(Next Generation Sequencing, NGS)的出現(xiàn),使得基因檢測(cè)效率不斷提高,從分子水平來(lái)監(jiān)測(cè)疫苗質(zhì)量更容易實(shí)現(xiàn)。本研究通過(guò)對(duì)Sabin株病毒NGS模板制備方法的討論,探討了如何去除背景核酸的干擾、低濃度樣品的擴(kuò)增方法選擇、樣品的純化定量篩選以及質(zhì)量鑒定,以及測(cè)序平臺(tái)的選擇等問(wèn)題。目的1.分析sIPV毒種(亞主種子、工作種子)及疫苗代次病毒(SO+4)、SO+5、SO+6的遺傳穩(wěn)定性；2.初步建立Sabin株病毒NGS樣品的預(yù)處理方法、擴(kuò)增方法、純化篩選方法以及測(cè)序平臺(tái)選擇等問(wèn)題,以期為進(jìn)一步研究Sabin株的遺傳穩(wěn)定性構(gòu)建一種切實(shí)可行的新方法。方法1.比較疫苗株Sabin Ⅰ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亞主種子、工作種子及疫苗代次病毒、SO+5、SO+6的感染性滴度及D抗原含量的變化情況,并對(duì)上述病毒進(jìn)行全基因組測(cè)序；2.采用常用的NGS樣品的預(yù)處理方法、擴(kuò)增方法、純化等方法制備Sabin株病毒NGS測(cè)序模板,比較篩選適用Sabin株病毒NGS的最佳組合,并對(duì)制備的模板進(jìn)行定量和質(zhì)量鑒定。結(jié)果1.各代次Sabin株病毒滴度均維持在7.62～8.62 1gCCID50/ml,D抗原含量均維持在30～128 DU/ml.與GenBank上登錄的Sabin Ⅰ (AY184219.1)、Ⅱ型(AY184220.1)及Sabin Ⅲ型(AY184221.1)減毒株原始種子(SO)基因序列相比,Sabin株亞主種子(S0+2)、工作種子(S0+3)及疫苗代次病毒(S0+4)、SO+5、SO+6均未出現(xiàn)堿基突變；2. Sabin株病毒NGS模板制備的樣品預(yù)處理是必要的,選用不依賴序列的單引物擴(kuò)增效果最好,優(yōu)化了磁珠純化法的磁珠用量,且采用Qubit定量系統(tǒng)定量更精確。結(jié)論1.sIPV毒種及疫苗代次病毒、SO+5、SO+6的病毒全基因序列與原始種子相比,均未發(fā)生變化,毒力均一,遺傳性狀方面保持了較好的穩(wěn)定性；2.初步建立了Sabin株病毒NGS的模板制備方法,并成功制備了Sabin株病毒NGS模板。
【關(guān)鍵詞】：Sabin株 脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗 毒種全基因組測(cè)序 毒種第二代測(cè)序 毒種遺傳穩(wěn)定性
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-15
• 1、Sabin株脊髓灰質(zhì)炎疫苗毒種遺傳穩(wěn)定性研究的意義及進(jìn)展9-12
• 2、Sabin株病毒深度測(cè)序的意義及現(xiàn)狀12-15
• 一、實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法15-40
• (一) 材料和儀器設(shè)備15-18
• 1、細(xì)胞15
• 2、脊灰病毒毒種15-16
• 3、試劑和器材16-17
• 4、主要儀器設(shè)備17-18
• 5、查詢使用的主要生物信息學(xué)工具18
• (二) 實(shí)驗(yàn)方法18-40
• 1、細(xì)胞培養(yǎng)18-19
• 2、病毒培養(yǎng)19-20
• 3、病毒滴度的檢測(cè)20
• 4、ELISA法測(cè)定D抗原含量20-22
• 5、病毒RNA提取22-24
• 6、Sanger測(cè)序引物設(shè)計(jì)及合成24-26
• 7、Sanger測(cè)序RT-PCR26-29
• 8、高保真酶DNA擴(kuò)增29-31
• 9、Sanger測(cè)序病毒基因序列的分析31
• 10、NGS樣品的預(yù)處理方法31-32
• 11、NGS模板的擴(kuò)增方法32-35
• 12、NGS模板純化方法35-36
• 13、NGS模板定量36-38
• 14、NGS模板質(zhì)量鑒定38-40
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-57
• (一) sIPV毒種遺傳穩(wěn)定性研究結(jié)果40-45
• 1、不同代次Sabin株的病毒滴度和D抗原含量40
• 2、RNA提取結(jié)果40-41
• 3、Sanger測(cè)序RT-PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果41-42
• 4、Sanger測(cè)序全基因序列比對(duì)結(jié)果42-45
• (二) Sabin株病毒深度測(cè)序模板制備方法探索結(jié)果45-57
• 1、RNA提取后是否進(jìn)行DNase Ⅰ消化電泳檢測(cè)結(jié)果45-46
• 2、NGS模板擴(kuò)增方法的優(yōu)化結(jié)果46-48
• 3、NGS模板制備的RT-PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果48-49
• 4、磁珠純化產(chǎn)物的電泳檢測(cè)、定量及質(zhì)量鑒定結(jié)果49-56
• 5、制備模板的完整性檢測(cè)結(jié)果56-57
• 三、討論57-66
• (一) sIPV毒種遺傳穩(wěn)定性研究57-59
• 1、sIPV毒種全基因組測(cè)序分析57-58
• 2、sIPV毒種感染性滴度和D抗原含量58
• 3、小結(jié)58-59
• (二) Sabin株深度測(cè)序模板制備方法探索59-64
• 1、Sabin株病毒NGS樣品的預(yù)處理59
• 2、Sabin株病毒NGS模板擴(kuò)增方法59-61
• 3、Sabin株病毒NGS模板純化方法61-62
• 4、Sabin株病毒NGS模板定量62-63
• 5、Sabin株病毒NGS模板質(zhì)量鑒定63-64
• 6、小結(jié)64
• (三) 結(jié)論與展望64-66
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 附錄71-75
• 附錄1 中英文縮略詞對(duì)照表71-73
• 附錄2 主要試劑的配制73-75
• 致謝75-76
• 研究生簡(jiǎn)歷76-77

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本文編號(hào)：657799