本文關(guān)鍵詞：弓形蟲毒力因子ROP18促進神經(jīng)細胞凋亡的機制研究

  更多相關(guān)文章： 弓形蟲 ROP18 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 凋亡 神經(jīng)細胞

【摘要】：背景：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii,簡稱弓形蟲)是頂復門的細胞內(nèi)專性寄生蟲,幾乎能感染所有的溫血動物,可引起在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的人獸共患寄生蟲病。正常人感染弓形蟲不會有明顯癥狀,對于免疫功能不全的病人和胎兒,弓形蟲病會引起嚴重感染,導致中樞神經(jīng)、眼、心臟、肺和肝臟等疾病。在弓形蟲感染的過程中,中樞神經(jīng)系統(tǒng)是所有入侵器官中最普遍的,會引起嬰兒小頭畸形、腦積水和脈絡膜視網(wǎng)膜炎等嚴重癥狀。ROP18是由弓形蟲棒狀體分泌的蛋白激酶,與蟲體毒力密切相關(guān),然而關(guān)于其對神經(jīng)系統(tǒng)的作用機制尚不清楚。本研究中通過對感染ROP18高表達轉(zhuǎn)基因弓形蟲小鼠腦組織免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)ROP18促進神經(jīng)細胞的凋亡。隨后,通過流式細胞術(shù)、免疫印跡法等實驗技術(shù)證實了ROP18是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑促進神經(jīng)細胞的凋亡。目的：探究弓形蟲毒力因子ROP18對神經(jīng)細胞凋亡影響,為弓形蟲神經(jīng)性侵害的分子機制研究奠定基礎(chǔ)。方法：用OMIGA軟件設(shè)計引物,構(gòu)建ROP18-pEGFP-C2真核表達載體。組織免疫熒光染色觀察小鼠腦組織神經(jīng)細胞的變化,流式細胞術(shù)和免疫印跡方法檢測神經(jīng)細胞的凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑中相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果：1.成功構(gòu)建ROP18-pEGFP-C2真核表達載體；Western blotting檢測ROP18在N2a神經(jīng)細胞中成功表達。2.高表達ROP18轉(zhuǎn)基因弓形蟲促進小鼠腦神經(jīng)元的凋亡分別取感染ROP18轉(zhuǎn)基因蟲株、RH蟲株小鼠和正常小鼠的腦組織,組織切片后做免疫熒光染色。共染鼠抗NeuN單克隆抗體(綠色),碘化丙啶PI(紅色),DAPI(藍色)。重疊圖表明：在未感染的正常組中,大腦皮層是完整的,神經(jīng)細胞數(shù)量較多且形態(tài)正常。相比于正常組,ROP18-RH蟲株和RH蟲株感染的小鼠大腦皮層和海馬區(qū)的神經(jīng)細胞明顯減少。此外,ROP18-RH蟲株感染的小鼠大腦皮層和海馬區(qū)的凋亡神經(jīng)細胞比RH蟲株感染組明顯增多。這些結(jié)果表明在感染弓形蟲的小鼠模型中ROP18促進小鼠腦組織神經(jīng)細胞的凋亡。3.ROP18促進N2a神經(jīng)細胞的凋亡(1)分別將ROP18-GFP、14-3-3-GFP、GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至N2a神經(jīng)細胞24小時后,流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)ROP18-GFP的凋亡率明顯高于對照組。(2)分別將高表達ROP18轉(zhuǎn)基因蟲株和RH蟲株(1:3)感染N2a細胞24小時后,流式細胞術(shù)檢測,顯示感染高表達ROP18轉(zhuǎn)基因蟲株的N2a細胞凋亡率明顯高于RH蟲株感染組。4.ROP18通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑促進神經(jīng)細胞的凋亡Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ROP18-GFP質(zhì)粒組和感染ROP18-RH蟲株組明顯增加了活化的Caspase-3、活化的Caspase-12和CHOP的表達水平,Z-ATAD-FMK (Caspase-12抑制劑)預處理后活化的Caspase-3和Caspase-12表達降低,CHOP的表達量沒有明顯變化。流式細胞術(shù)檢測顯示Z-ATAD-FMK預處理后轉(zhuǎn)染ROP18-GFP質(zhì)粒組和感染ROP18-RH蟲株組的凋亡率減低。結(jié)論：本研究顯示,弓形蟲毒力因子ROP18可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress)途徑促進神經(jīng)細胞的凋亡,這為弓形蟲神經(jīng)性損傷的分子機制研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 ROP18 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 凋亡 神經(jīng)細胞
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7;R382.5
【目錄】：

• 英文縮略詞表(Abbreviation)7-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 1 前言15-17
• 2 實驗材料17-22
• 2.1 細胞株、菌株、蟲株17-18
• 2.2 質(zhì)粒18
• 2.3 實驗動物18
• 2.4 抗體18
• 2.5 主要試劑18-19
• 2.6 主要試劑溶液的配制19-21
• 2.7 主要儀器與設(shè)備21-22
• 3 實驗方法22-34
• 3.1 弓形蟲株的復蘇與保種22-23
• 3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及提取23-29
• 3.2.1 引物設(shè)計及合成23
• 3.2.2 RH蟲株速殖子總RNA的提取及cDNA的合成23-24
• 3.2.3 PCR擴增目的基因24
• 3.2.4 凝膠回收24-25
• 3.2.5 酶切25-26
• 3.2.6 連接26
• 3.2.7 TOP10感受態(tài)細胞的制備與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化26-27
• 3.2.8 重組質(zhì)粒的小量提取27-28
• 3.2.9 重組質(zhì)粒的鑒定28
• 3.2.10 質(zhì)粒的中量提取28-29
• 3.2.11 質(zhì)粒的無菌化處理29
• 3.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染29-31
• 3.3.1 細胞培養(yǎng)29-30
• 3.3.2 轉(zhuǎn)染30-31
• 3.4 免疫印跡(Immunoblotting,IB)31-33
• 3.4.1 蛋白樣品的制備31
• 3.4.2 SDS-PAGE膠的配制31-32
• 3.4.3 上樣電泳32
• 3.4.4 轉(zhuǎn)膜32
• 3.4.5 IB檢測32-33
• 3.5 腦組織免疫熒光33-34
• 3.5.1 腦組織提取及組織切片33
• 3.5.2 免疫熒光33-34
• 3.6 流式細胞術(shù)34
• 4 結(jié)果34-49
• 4.1 ROP18質(zhì)粒的構(gòu)建及在N2a神經(jīng)細胞中的表達34-36
• 4.2 高表達ROP18轉(zhuǎn)基因弓形蟲促進小鼠腦神經(jīng)元的凋亡36-39
• 4.3 ROP18促進N2a神經(jīng)細胞的凋亡39-42
• 4.4 ROP18通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑促進N2a神經(jīng)細胞的凋亡42-49
• 4.4.1 Caspase-12抑制劑預處理對ROP18誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響42-45
• 4.4.2 Caspase-12抑制劑預處理對ROP18引起的凋亡相關(guān)蛋白表達的影響45-49
• 5 討論49-50
• 6 結(jié)論50
• 7 創(chuàng)新點50
• 8 參考文獻50-55
• 附錄55-57
• 致謝57-58
• 綜述58-67
• 參考文獻64-67

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本文編號：654699