本文關(guān)鍵詞：與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向造血分化體系的研究

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【摘要】：背景:造血干細(xì)胞(HSC)是所有脊椎動(dòng)物造血細(xì)胞形成的中心環(huán)節(jié),移植后可完全重建造血功能,因此,同種異體造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是治療許多血液疾病(如白血病、地中海貧血、血液腫瘤)的關(guān)鍵。臨床上,成體造血干細(xì)胞主要來源于骨髓及臍帶血,而由于來源受限及免疫排斥極大地阻礙了造血干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。胚胎干細(xì)胞(ES)為一類多能干細(xì)胞,在體外可無限擴(kuò)增,且在特定條件下具有向造血干細(xì)胞分化的潛能,解決了細(xì)胞來源受限、免疫排斥等問題,為人類再生醫(yī)學(xué)和個(gè)體化細(xì)胞替代療法提供了無限的細(xì)胞來源。ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)造血分化的研究是較為深入的領(lǐng)域之一。其中,OP9細(xì)胞是常用的用于誘導(dǎo)造血分化的基質(zhì)細(xì)胞系,傳統(tǒng)的共培養(yǎng)誘導(dǎo)周期約為2-3周,耗時(shí)長(zhǎng),本實(shí)驗(yàn)選用該誘導(dǎo)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過探究最佳OP9細(xì)胞的接種密度,以達(dá)到縮短誘導(dǎo)分化周期的目的,優(yōu)化體外造血分化體系。通過體外誘導(dǎo)造血分化的技術(shù),建立人胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)造血分化的平臺(tái),為干細(xì)胞治療奠定基礎(chǔ),也為研究造血細(xì)胞的發(fā)生生育的調(diào)控機(jī)制提供了依據(jù)。目的:探索OP9共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化的最優(yōu)條件,為體外誘導(dǎo)分化及機(jī)制研究建立平臺(tái)。方法:傳統(tǒng)的與小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞OP9細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化,OP9細(xì)胞前期培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化過程的周期約為2-3周,我們利用本實(shí)驗(yàn)室已建系的人胚胎干細(xì)胞株HN14,將OP9細(xì)胞設(shè)置成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組:OP9細(xì)胞密度設(shè)置6個(gè)梯度即1.5,2.5,3.5,5.0,6.5,8.0×105/ml接種至10cm皿培養(yǎng)24h后,即與HN14共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化;對(duì)照組:應(yīng)用傳統(tǒng)方法,將OP9細(xì)胞按1.5×105/ml接種培養(yǎng)4天后,達(dá)到融合狀態(tài)后進(jìn)行共培養(yǎng)。通過觀察形態(tài)變化、流式檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及集落形成實(shí)驗(yàn)比較造血分化的效率。結(jié)果:無論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組,鏡下觀察,ES細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度地分化。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)過程中第8、10、12天的CD34細(xì)胞陽性率,對(duì)照組在第12天達(dá)高峰,CD34的陽性率達(dá)10%左右,相較而言,在實(shí)驗(yàn)組中,CD34的陽性率提前2天達(dá)高峰,即在共培養(yǎng)第10天達(dá)高峰,且分化效率與對(duì)照組無差異(P值0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,中胚層的標(biāo)志性基因BRACHYURY,呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),在對(duì)照組在第6天達(dá)高峰,而實(shí)驗(yàn)組在第4天表達(dá)達(dá)高峰,這與CD34的表達(dá)高峰出現(xiàn)時(shí)間相一致。磁珠分選CD34+細(xì)胞進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn),證實(shí)其具有向各系造血祖細(xì)胞分化的能力。本課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與傳統(tǒng)的OP9細(xì)胞需培養(yǎng)4天后進(jìn)行共培養(yǎng)的方法相比,以5.0-6.5×105/ml密度接種OP9細(xì)胞培養(yǎng)僅24h,共培養(yǎng)10天即可達(dá)到與對(duì)照組相似的分化效率,使誘導(dǎo)分化的周期足足縮短了3-5天,大大提高了分化效率。結(jié)論:1.利用與小鼠OP9基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的誘導(dǎo)體系,在本實(shí)驗(yàn)室建立了體外誘導(dǎo)造血分化的平臺(tái),為之后的機(jī)制性研究實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。2.探究最佳OP9細(xì)胞接種密度,以5.0-6.5×105/ml接種OP9細(xì)胞24h后誘導(dǎo)分化效率與傳統(tǒng)方法一致,縮短了造血分化的誘導(dǎo)周期,優(yōu)化體外誘導(dǎo)造血分化體系。
【關(guān)鍵詞】：人胚胎干細(xì)胞 OP9 細(xì)胞 共培養(yǎng) 造血干/前體細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 中英文對(duì)照表12-13
• 前言13-15
• 1 實(shí)驗(yàn)材料15-20
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)耗材15-16
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑16-17
• 1.4 試劑的配制17-18
• 1.5 試劑主要成分說明18-19
• 1.6 細(xì)胞株19-20
• 2 實(shí)驗(yàn)方法20-29
• 2.1 細(xì)胞株的凍融與傳代20-22
• 2.2 人ES細(xì)胞與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)定向誘導(dǎo)造血分化22-23
• 2.3 造血分化效率的評(píng)估與鑒定23-28
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法28-29
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-40
• 3.1 人ES細(xì)胞及OP9細(xì)胞的培養(yǎng)及形態(tài)觀察29-31
• 3.2 人ES細(xì)胞與OP9共培養(yǎng)定向誘導(dǎo)造血分化31-40
• 4 討論40-45
• 4.1 體外有效誘導(dǎo)人ES細(xì)胞定向分化為造血干/前體細(xì)胞的建立40-42
• 4.2 體外誘導(dǎo)方法的改進(jìn)42-43
• 4.3 展望43-45
• 5 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 綜述 多能干細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景49-65
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及碩士期間發(fā)表論文65-66
• 致謝66

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