本文關(guān)鍵詞：靶向上皮細(xì)胞粘附分子單域抗體的篩選及其表達(dá)純化

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【摘要】：目的:通過(guò)篩選噬菌體單域抗體文庫(kù),獲得靶向上皮細(xì)胞粘附分子的單克隆單域抗體,并對(duì)候選單域抗體進(jìn)行表達(dá)純化,為今后將這些單域抗體用于癌癥治療奠定基礎(chǔ)。方法:1.制備噬菌體單域抗體文庫(kù);2.選擇可應(yīng)用于后續(xù)淘選實(shí)驗(yàn)的抗原片段,并對(duì)其進(jìn)行分析和合成;3.使用合成的上皮細(xì)胞粘附分子抗原片段對(duì)此文庫(kù)進(jìn)行5輪篩選;4.從第5輪篩選的單域抗體文庫(kù)中隨機(jī)挑取單克隆噬菌體抗體,檢測(cè)其與抗原的結(jié)合;5.檢測(cè)獲得的單克隆噬菌體單域抗體與抗原結(jié)合的特異性及其DNA序列;6.檢測(cè)獲得的噬菌體單域抗體與完整的上皮細(xì)胞粘附分子的結(jié)合;7.對(duì)單域抗體進(jìn)行蛋白表達(dá)純化和鑒定。結(jié)果:1.成功地制備了噬菌體單域抗體文庫(kù),其滴度為4.4 X 1013 pfu/ml;2.選擇了上皮細(xì)胞粘附分子基因第二個(gè)外顯子編碼的一段多肽作為抗原片段,并成功合成純度達(dá)95%以上的抗原片段;3.完成了噬菌體單域抗體文庫(kù)的5輪篩選;4.隨機(jī)挑取和檢測(cè)了478個(gè)單克隆噬菌體單域抗體,從中獲得了30個(gè)候選單域抗體;5.通過(guò)進(jìn)一步鑒定從中獲得了17個(gè)單域抗體,分析其DNA序列,排除重復(fù)的序列后,獲得5個(gè)不同的單域抗體;6.其中得到3個(gè)單克隆噬菌體單域抗體能夠與完整的上皮細(xì)胞粘附分子結(jié)合;7.成功地表達(dá)和純化了5個(gè)單域抗體,這些純化的單域抗體能夠與合成的抗原片段和完整的上皮細(xì)胞粘附分子結(jié)合。結(jié)論:本研究最終獲得了5個(gè)單克隆噬菌體單域抗體,成功地表達(dá)和純化了這些單域抗體,且獲得的單域抗體能夠與完整的上皮細(xì)胞粘附分子結(jié)合。
【關(guān)鍵詞】：癌癥干細(xì)胞 單域抗體 上皮細(xì)胞粘附分子
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 前言8-19
• 1 EpCAM的簡(jiǎn)介8-17
• 1.1 EpCAM蛋白的結(jié)構(gòu)和表達(dá)8-11
• 1.2 EpCAM的活化11-12
• 1.3 EpCAM的一般功能12-13
• 1.4 EpCAM對(duì)癌細(xì)胞增殖的作用13-14
• 1.5 EpCAM在腫瘤形成中的作用14
• 1.6 EpCAM在癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用14-16
• 1.7 EpCAM在腫瘤診斷和治療中的作用16
• 1.8 EpCAM在癌細(xì)胞耐藥性中的作用16-17
• 2 單克隆抗體17
• 3 噬菌體展示技術(shù)17-18
• 4 抗體片段和人源單域抗體18-19
• 第二章 材料和方法19-35
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19-25
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑20-21
• 1.3 主要試劑的配制方法21-25
• 2 實(shí)驗(yàn)方法25-35
• 2.1 制備輔助噬菌體25-26
• 2.2 制備噬菌體單域抗體文庫(kù)26
• 2.3 純化噬菌體單域抗體文庫(kù)26
• 2.4 篩選噬菌體單域抗體文庫(kù)26-27
• 2.5 單克隆噬菌體ELSIA27-28
• 2.6 單域抗體的PCR擴(kuò)增28-29
• 2.7 DNA瓊脂糖凝膠電泳29
• 2.8 PCR產(chǎn)物的切膠回收29-30
• 2.9 雙酶切反應(yīng)30-31
• 2.10 酶連反應(yīng)31
• 2.11 DH5α和BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備31
• 2.12 將連接產(chǎn)物或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞31-32
• 2.13 菌液PCR及DNA測(cè)序32
• 2.14 質(zhì)粒小量抽提32-33
• 2.15 單域抗體的原核表達(dá)33-34
• 2.16 表達(dá)的蛋白質(zhì)的親和純化步驟34
• 2.17 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析34-35
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-56
• 1 噬菌體單域抗體文庫(kù)的制備35
• 2 抗原片段的選擇和制備35-40
• 3 噬菌體單域抗體文庫(kù)的篩選40-42
• 4 單克隆噬菌體單域抗體的初步篩選42-44
• 5 單克隆噬菌體抗體與抗原結(jié)合特異性的分析44-45
• 6 單域抗體的氨基酸序列45-47
• 7 單克隆噬菌體單域抗體與完整的EpCAM蛋白結(jié)合的檢測(cè)47-48
• 8 單域抗體的表達(dá)純化48-54
• 9 純化的單域抗體與EpCAM抗原結(jié)合的檢測(cè)54-56
• 第四章 討論56-58
• 第五章 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 在校期間發(fā)表論文情況66-67
• 致謝67

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