本文關鍵詞：葡萄糖和O-GlcNAc糖基化對hBMSCs的影響

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【摘要】：一、研究背景人骨髓間充質干細胞(hBMSCs)因其較強的增殖能力和潛在的分化多能性在組織工程再生醫(yī)學領域有著廣闊的發(fā)展前景。然而當前體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),部分hBMSCs會出現(xiàn)增殖緩慢、過早凋亡、衰老甚至分化抑制等問題,嚴重影響其作為種子細胞的運用,而hBMSCs外培養(yǎng)的微環(huán)境則在其中扮演著重要的角色。葡萄糖作為生命的核心能量來源和重要代謝產(chǎn)物,體內外微環(huán)境中葡萄糖顯著影響著細胞的增殖、凋亡、衰老和分化。氨基己糖合成通路(HBP)是細胞營養(yǎng)狀態(tài)的感應器,微環(huán)境中葡萄糖濃度變化可以通過HBP影響細胞內蛋白質的O-GlcNAc糖基化水平。O-GlcNAc糖基化作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式,眾多細胞核、細胞質和線粒體蛋白質都可以被其修飾,在細胞生命活動中發(fā)揮著重要作用。O-GlcNAc糖基化影響細胞增殖、凋亡、衰老、分化、代謝調節(jié)、壓力反應等,其異常與人類多種疾病有關。另外,磷酸化和O-GlcNAc糖基化在細胞生命活動中有著復雜聯(lián)系:它們可以在蛋白質發(fā)生同、異位點競爭抑制和協(xié)同作用等現(xiàn)象。細胞周期蛋白(Cyclin D1)是細胞周期的正調節(jié)因子,caspase-3是直接作用于細胞引發(fā)凋亡的關鍵終端因子。O-GlcNAc糖基化抑制PKCα的活性。高糖環(huán)境TGF-β誘導的hBMSCs成軟骨分化中活性降低、TGF-βRⅡ表達量下調。因此探究葡萄糖對hBMSCs的影響,及O-GlcNAc糖基化在其中發(fā)揮哪些作用有著重要價值。本課題研究中,我們首先觀察體外培養(yǎng)微環(huán)境中高糖環(huán)境和細胞蛋白質高O-GlcNAc糖基化對hBMSCs增殖、衰老、凋亡和成軟骨分化的影響,再對其中的部分機制進行了探索。二、研究方法1.實驗分組:常糖組(葡萄糖5.5mmol/L),高糖培養(yǎng)基(葡萄糖25mmol/L),常糖O-GlcNAc糖基化組(葡萄糖5.5mmol/L,Thiamet-G 1.0mol/L),高糖O-GlcNAc糖基化組(葡萄糖25mmol/L,Thiamet-G 1.0mol/L)。Thiamet-G為O-GlcNAc糖基化水解酶抑制劑。成軟骨分化常規(guī)誘導組、成軟骨分化O-GlcNAc糖基化誘導組(Thiamet-G)、成軟骨分化PKC抑制劑誘導組(G?6983)。G?6983為PKC活性抑制劑。2.葡萄糖對細胞蛋白質O-GlcNAc糖基化的影響。hBMSCs于常糖和高糖環(huán)境培養(yǎng)5天后,Western blot檢測hBMSCs內總體蛋白質的O-GlcNAc糖基化水平3.葡萄糖與O-GlcNAc糖基化對hBMSCs增殖的影響。hBMSCs培養(yǎng)1、3、5、7天后,WST-1法檢測hBMSCs增殖。4.葡萄糖與O-GlcNAc糖基化對hBMSCs周期作用。hBMSCs培養(yǎng)5天后,流式細胞儀檢測細胞周期,RT-PCR檢測細胞Cyclin D1表達水平。5.葡萄糖與O-GlcNAc糖基化對hBMSCs凋亡作用。hBMSCs培養(yǎng)5天后,流式細胞儀檢測hBMSCs凋亡,RT-PCR檢查caspase-3表達水平。6.葡萄糖與O-GlcNAc糖基化對hBMSCs衰老作用。hBMSCs培養(yǎng)5天后,β-半乳糖糖苷染色法檢測hBMSCs衰老。7.葡萄糖與O-GlcNAc糖基化對hBMSCs向軟骨分化作用。實時定量PCR檢查成軟骨分化的標志:Sox9、ColⅡ、AGN基因的表達;Western blot檢測PKC、p-PKC、TGF-βRⅡ蛋白表達。三、研究結果1.高糖組相較于低糖組hBMSCs蛋白質O-GlcNAc糖基化水平升高。2.高糖組、低糖O-GlcNAc糖基化組和高糖O-GlcNAc糖基化組相較于低糖組抑制hBMSCs增殖。3.高糖組、低糖O-GlcNAc糖基化組和高糖O-GlcNAc糖基化組相較于低糖組阻滯hBMSCs G1/S期轉換、下調Cyclin D1 m RNA表達。4.高糖組、低糖O-GlcNAc糖基化組和高糖O-GlcNAc糖基化組相較于低糖組促進hBMSs凋亡,上調caspase-3 m RNA表達。5.高糖組、低糖O-GlcNAc糖基化組相較于低糖組下調hBMSs成軟骨分化標志Sox9、ColⅡ、AGN m RNA表達,阿爾新藍染色變淺軟骨組織中酸性粘多糖含量減少。6.成軟骨分化O-GlcNAc糖基化誘導組、成軟骨分化PKC抑制劑誘導組相較于成軟骨分化常規(guī)誘導組,PKC表達量相同但磷酸化PKC表達量顯著降低,TGF-βRⅡ表達顯著下調。四、結論1.本研究證實微環(huán)境中高糖會促進hBMSCs細胞內蛋白質O-GlcNAc糖基化水平升高。鑒于O-GlcNAc糖基化在細胞生命活動的廣泛作用,該結果產(chǎn)生的一系列生物學效應值得我們深入探究2.本研究證實高糖微環(huán)境抑制hBMSCs細胞增殖、阻滯其G1/S期轉換、促進其凋亡和衰老。3.本研究證實蛋白質高O-GlcNAc糖基化抑制hBMSCs細胞增殖、阻滯其G1/S期轉換、促進其凋亡和衰老。4.本研究證實高糖環(huán)境和高O-GlcNAc糖基化抑制hBMSCs成軟骨分化。且PKC高O-GlcNAc糖基化下調PKC磷酸化及活性,進而引起TGF-βRⅡ表達量降低,最終導致TGF-β介導的hBMSCs成軟骨分化進程受到抑制。
【關鍵詞】：骨髓間充質干細胞 葡萄糖 O-GlcNAc糖基化 增殖 周期 凋亡 衰老 成軟骨分化
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 葡萄糖對O-GlcNAc糖基化的影響14-18
• 2.1 葡萄糖對O-GlcNAc糖基化的影響14-17
• 2.1.1 實驗材料14-15
• 2.1.2 實驗方法15-16
• 2.1.3 實驗結果16-17
• 2.1.4 討論17
• 2.2 小結17-18
• 第三章 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化對hBMSCs增殖、周期、凋亡和衰老的影響18-38
• 3.1 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化對hBMSCs增殖的影響18-21
• 3.1.1 實驗材料18-19
• 3.1.2 實驗方法19-20
• 3.1.3 實驗結果20
• 3.1.4 討論20-21
• 3.2 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化對hBMSCs周期的影響21-28
• 3.2.1 實驗材料21-22
• 3.2.2 實驗方法22-25
• 3.2.3 實驗結果25-27
• 3.2.4 討論27-28
• 3.3 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化對hBMSCs凋亡的影響28-34
• 3.3.1 實驗材料28-29
• 3.3.2 實驗方法29-31
• 3.3.3 實驗結果31-33
• 3.3.4 討論33-34
• 3.4 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化對hBMSCs衰老的影響34-37
• 3.4.1 實驗材料34
• 3.4.2 實驗方法34-36
• 3.4.3 實驗結果36-37
• 3.4.4 討論37
• 3.5 小結37-38
• 第四章 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化對hBMSCs成軟骨分化的影響38-48
• 4.1 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化對hBMSCs成軟骨分化的影響38-47
• 4.1.1 實驗材料38-39
• 4.1.2 實驗方法39-43
• 4.1.3 實驗結果43-46
• 4.1.4 討論46-47
• 4.2 小結47-48
• 全文結論48-49
• 參考文獻49-53
• 文獻綜述 O-GlcNAc糖基化：聯(lián)系葡萄糖和細胞分化的橋梁53-71
• 參考文獻59-71
• 讀碩士學位期間發(fā)表論文情況71-72
• 致謝72

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉華東;陳永湘;趙玉芬;李艷梅;;O-GlcNAc修飾研究進展[J];中國科技論文在線;2007年08期

2 叢琦;顧玉超;于文功;;蛋白質O-GlcNAc修飾的檢測技術[J];中國生物化學與分子生物學報;2012年06期

3 覃培斌;董潤安;彭博;應萬濤;錢小紅;;O-GlcNAc糖蛋白/糖肽的分離富集方法[J];生命的化學;2013年02期

4 王s，

本文編號：623302