發(fā)布時間：2017-07-29 01:03

  本文關鍵詞：酵母相馬爾尼菲青霉黑素的生成和TYR基因的關系及次級代謝產(chǎn)物的研究

  更多相關文章： 馬爾尼菲青霉菌 L-DOPA TYR 次級代謝產(chǎn)物 UPLC-MS/MS

【摘要】：目的(1)探索LDOPA對酵母相馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei,PM)的作用,從觀察培養(yǎng)基的顏色、菌落形態(tài)和顏色、光學顯微鏡下形態(tài)和熒光定量PCR儀檢測目的基因酪氨酸酶基因(TYR)表達的角度初步探討不同培養(yǎng)基在有或無L-DOPA對酵母相馬爾尼菲青霉的作用。(2)建立同時測定黃曲霉素、膠霉素、交沙霉素3種有效成分的量的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)分析方法及檢測酵母相馬爾尼菲青霉(PM)能否產(chǎn)生如黃曲霉素、膠霉素、交沙霉素等次級代謝產(chǎn)物。方法(1)將2株馬爾尼菲青霉菌株分別在含和不含1.0 mM L-DOPA的沙氏培養(yǎng)基、腦心浸汁培養(yǎng)基(BHI)以及含10%的胎牛血清的高糖固體培養(yǎng)基(DMEM)進行酵母相避光培養(yǎng)3天,觀察菌落、培養(yǎng)基顏色及鏡下觀察形態(tài)學的變化以及熒光定量PCR測定酪氨酸酶基因(TYR)的表達。(2)采用Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (2.1×50mm,1.8μm)色譜柱；選擇含甲醇(A)-0.1%甲酸的水(B)為流動相,體積流量為0.3mI/ min。在電噴霧電離正離子模式下采用MRM檢測。將PM標準株FRR和臨床人分離株GXMUDXR分別在含10%的胎牛血清的高糖液體培養(yǎng)基進行酵母相培養(yǎng)7天,經(jīng)前處理后檢測黃曲霉素、膠霉素、交沙霉素這三種有效成分。結果(1)2株受試菌株在沙氏固體培養(yǎng)基中37。C避光培養(yǎng)3天,含L-DOPA和不含L-DOPA的PM菌株菌落顏色均無明顯改變；(2)2株受試菌株在腦心浸膏培養(yǎng)基(BHI)上37。C避光培養(yǎng)3天,不含L-DOPA培養(yǎng)基上的菌落較含L-DOPA培養(yǎng)基的菌落顏色淺；(3)2株受試菌株在含10%胎牛血清高糖固體培養(yǎng)基上37。C避光培養(yǎng)3天,不含L-DOPA培養(yǎng)基上的菌落顏色淺,而含L-DOPA培養(yǎng)基上的菌落顏色變黑,且含L-DOPA不含PM菌株的培養(yǎng)基顏色也變黑；(4)光學顯微鏡下觀察結果：2株受試菌株在沙氏培養(yǎng)基、含和不含L-DOPA的BHI培養(yǎng)基、含和不含L-DOPA的10%胎牛血清的DMEM上37。C培養(yǎng)3天后,各個培養(yǎng)基上的PM酵母細胞的形態(tài)、大小基本一致,均未見到被染成黑色；(5)熒光定量PCR檢測酪氨酸酶基因的表達：a.BHI培養(yǎng)基組：含和不含L-DOPA的竹鼠分離株PM及臨床人分離株PM中TYR基因的表達量均高于同組沙氏培養(yǎng)基組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；且同組中含L-DOPA的BHI組中TYR的表達量高于不含L-DOPA的BHI組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。b.含10%胎牛血清的DMEM組：結果顯示含和不含L-DOPA的標準株PM及臨床株PM中TYR基因的表達量與同組沙氏培養(yǎng)基組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。且同組含和不含L-DOPA的10%胎牛血清的DMEM組相互比較,兩者TYR的表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(5)與標準品比較,酵母相馬爾尼菲青霉菌未檢測出與黃曲霉素、膠霉素類似的目標峰,但各個樣品甚至是空白對照,均出現(xiàn)與交沙霉素類似的目標峰,但強度遠遠小于標準品。結論(1)PM菌株在含有L-DOPA的BHI培養(yǎng)基中可以利用L-DOPA產(chǎn)生黑色素。(2)在BHI培養(yǎng)基中添加外源L-DOPA能提高PM菌株酪氨酸酶基因的表達。(3)本實驗未能檢出馬爾尼菲青霉菌中黃曲霉素、膠霉素、交沙霉素這三種次級代謝產(chǎn)物成分。
【關鍵詞】：馬爾尼菲青霉菌 L-DOPA TYR 次級代謝產(chǎn)物 UPLC-MS/MS
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R379
【目錄】：

• 個人簡歷3-5
• 主要英文縮略詞5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 第一部分 酵母相馬爾尼菲青霉黑素的生成和TYR基因的關系14-39
• 材料和方法15-24
• 結果24-32
• 討論32-38
• 小結38
• 展望38-39
• 第二部分 酵母相馬爾尼菲青霉次級代謝產(chǎn)物的研究39-52
• 材料和方法40-43
• 結果43-47
• 討論47-50
• 小結50-51
• 展望51-52
• 參考文獻52-61
• 綜述61-74
• 參考文獻69-74
• 致謝74-75
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文75

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