本文關(guān)鍵詞：人可溶性sTNFR1及胞膜外區(qū)Ig融合基因重組腺病毒的真核表達(dá)及功能活性鑒定

  更多相關(guān)文章： 人可溶性TNF受體 免疫球蛋白G 哮喘 妊娠 腺病毒 真核表達(dá)

【摘要】：目的構(gòu)建攜帶人sTNFR1與IgGFc片段融合基因的重組腺病毒,穩(wěn)定表達(dá)并初步鑒定其功能活性在妊娠哮喘炎癥機(jī)制中的作用。方法將PCR擴(kuò)增的sTNFR1及IgGFc基因片段先后連接到穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV多克隆位點(diǎn)上,酶切線性化后在BJ5183細(xì)菌內(nèi)與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1同源重組,產(chǎn)生獲得的AdE-EGFP-sTNFR1-Ig以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,以綠色熒光蛋白(GFP)監(jiān)測(cè)病毒滴度及感染效率。RT-PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞內(nèi)重組腺病毒轉(zhuǎn)錄及融合基因與蛋白表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)、ELISA實(shí)驗(yàn)分析混合培養(yǎng)上清中轉(zhuǎn)染肥大細(xì)胞(MC)激活、調(diào)節(jié)同基因來源T細(xì)胞表達(dá)Th2/Treg水平及細(xì)胞因子分泌效果;MTT評(píng)估轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中sTNFR1-Ig對(duì)TNF-α介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)的拮抗作用。結(jié)果成功構(gòu)建編碼sTNFR1-Ig基因的重組腺病毒載體經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確,制備的腺病毒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的GFP表達(dá)以及CPE效應(yīng)明顯,擴(kuò)增后的滴度為3.7×1010～4.8×1010pfu/ml,體外感染效率可達(dá)90%以上;sTNFR1-Ig基因在mRNA及蛋白水平獲得的清晰條帶均證實(shí)腺病毒包裝與擴(kuò)增成功。表達(dá)sTNFR1-Ig的MC誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞水平以及IL-12含量均明顯升高,CD4+IL-4+Th2細(xì)胞水平下調(diào)(P0.05),Th2/Treg所占CD4+T細(xì)胞比值下降(P0.05)。sTNFR1-Ig封閉TNF-α對(duì)MC免疫毒性作用的濃度效應(yīng)明顯,而EGFP-MCs與對(duì)照細(xì)胞上清對(duì)TNF-α毒性效應(yīng)的中和阻斷能力不足(P0.05)。結(jié)論攜sTNFR1-Ig基因重組腺病毒參與的免疫調(diào)控與妊娠期哮喘發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。sTNFR1及IgG-Fc亞基胞膜外區(qū)結(jié)合的表達(dá)和引起免疫耐受的作用研究,為妊娠哮喘發(fā)病機(jī)制在理論上的新突破,為以sTNFRI-Ig為靶點(diǎn)的妊娠哮喘干預(yù)治療奠定基礎(chǔ)。
【作者單位】： 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科;Department
【關(guān)鍵詞】： 人可溶性TNF受體 免疫球蛋白G 哮喘 妊娠 腺病毒 真核表達(dá)
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81100441)
【分類號(hào)】：R373.1
【正文快照】： 妊娠期哮喘是圍生期常見合并癥,其病因及發(fā)病機(jī)制目前仍未闡明。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為妊娠期哮喘發(fā)病的中心環(huán)節(jié)與母體多項(xiàng)炎癥及免疫因子水平變化有關(guān)[1]。有資料證實(shí)[2],人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factoralpha,TNF-α)與各種原因?qū)е碌娜焉锷砗?或)病理現(xiàn)象如免疫性疾病

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本文編號(hào)：584229