本文關(guān)鍵詞：埃及伊蚊yellow基因家族表達(dá)譜分析及rAa-Yc蛋白的功能初探

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【摘要】：目的:篩選并鑒定埃及伊蚊(Aedes aegypti)全基因組中yellow基因,分析其基因結(jié)構(gòu)、基因進(jìn)化以及在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)譜。并針對(duì)Aa-Yc作為研究對(duì)象,通過重組表達(dá)以獲取rAa-Yc活性蛋白,并對(duì)其可能的功能進(jìn)行初步探索,為進(jìn)一步探討其在病原與蚊蟲宿主的相互作用奠定基礎(chǔ)。方法:運(yùn)用模式昆蟲黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)Dm-yellow基因(GenBank No.AAF45497)的王漿主蛋白(Major royal jelly protein,MRJP)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列,在埃及伊蚊全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選并鑒定埃及伊蚊yellow基因家族,采用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(ExPASy)在線相關(guān)工具包分析其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域,運(yùn)用SignalP4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽,結(jié)合使用DNAstar、MEGA6.0和GeneDoc軟件包進(jìn)行同源性比對(duì)、保守性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建。提取埃及伊蚊總RNA,合成cDNA,利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法對(duì)埃及伊蚊不同發(fā)育時(shí)期(卵、Ⅰ~Ⅳ齡幼蟲、蛹以及未吸血雌蚊和雄蚊)和未吸血雌蚊不同組織(唾液腺、中腸、脂肪體和卵巢)的表達(dá)譜進(jìn)行相對(duì)定量分析,并構(gòu)建Aa-Yc基因在埃及伊蚊吸血后唾液腺中的階段性表達(dá)譜(飽血0時(shí)、飽血24 h)。從Vecterbase上埃及伊蚊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取埃及伊蚊唾液腺黃蛋白Aa-yellow-c(Aa-Yc)(GenBank No.EAT40936)的全長(zhǎng)序列,利用ExPASy中有關(guān)基因和蛋白序列的分析工具,分析預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能;設(shè)計(jì)基因特異性引物采用RT-PCR技術(shù)從埃及伊蚊(廣東電白株)雌蚊體內(nèi)擴(kuò)增Aa-Yc基因成熟肽序列,并將其克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pEasy-E1和真核表達(dá)質(zhì)粒pMT/Bip/V5-HisA。原核表達(dá)重組質(zhì)粒pEasy-E1-Aa-Yc在大腸桿菌Rosetta(DE3)中經(jīng)用異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(western blotting)鑒定。鎳柱純化后的r Aa-Yc經(jīng)皮下注射免疫新西蘭大白兔制備重組抗體,采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)抗體效價(jià)。真核表達(dá)重組質(zhì)粒pMT/Bip/V5-Aa-Yc和篩選載體pCoHygro經(jīng)電穿孔共轉(zhuǎn)染入果蠅S2細(xì)胞,經(jīng)潮霉素B壓力篩選建立穩(wěn)定表達(dá)Aa-Yc的S2細(xì)胞系。采用手工法檢測(cè)raa-yc對(duì)人全血部分凝血酶原時(shí)間(prothrombintime,pt),凝血酶時(shí)間(thrombintime,tt)及凝血活酶時(shí)間(activatedpartialthromboplastintime,aptt)的影響;血小板聚集儀檢測(cè)raa-yc對(duì)二磷酸腺苷(denosinediphosphate,adp)誘導(dǎo)的人血小板聚集功能的影響。結(jié)果:從埃及伊蚊全基因組中篩選出12條yellow基因(aa-yellow、aa-yellow-b、aa-yellow-c、aa-yellow-d、aa-yellow-e、aa-yellow-f2、aa-yellow-fb、aa-yellow-fc、aa-yellow-g、aa-yellow-g2、aa-yellow-h和aa-yellow-x)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,12條yellow基因均具有mrjp結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽序列。同源性比對(duì)結(jié)果顯示,埃及伊蚊yellow基因家族成員間相似性較低,為15%~49%;但其保守域間同源性較高,可達(dá)60%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,12個(gè)yellow蛋白分為5個(gè)亞家族,其中11個(gè)在黑腹果蠅中均有直系同源蛋白存在。qrt-pcr結(jié)果顯示,aa-yellow-d和aa-yellow-x在雄蚊中高表達(dá)(p0.01或p0.05);aa-yellow-fc在雌蚊和唾液腺中特異高表達(dá)(p0.01);aa-yellow-f2在2齡幼蟲中特異高表達(dá)(p0.01);aa-yellow、aa-yellow-e和aa-yellow-fb在3齡幼蟲中特異高表達(dá)(p0.01);aa-yellow、aa-yellow-e、aa-yellow-f2、aa-yellow-fb、aa-yellow-h和aa-yellow-x等6條基因在卵巢中高表達(dá)(p0.01或p0.05);除aa-yellow-c和aa-yellow-x,其余基因幾乎不在中腸表達(dá);其中aa-yc(aa-yellow-c)在Ⅰ齡幼蟲時(shí)期高表達(dá),在不同組織中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在蚊蟲吸血后的唾液腺中表達(dá)量顯著上調(diào)。aa-yc序列全長(zhǎng)1852bp,1~1287位為開放閱讀框,n端含有一個(gè)由27個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽,生物信息學(xué)分析顯示其具有mrjp結(jié)構(gòu)域。rt-pcr擴(kuò)增獲得其成熟肽基因,將其克隆入peasy-e1載體,經(jīng)pcr及dna測(cè)序證實(shí)peasy-e1-aa-yc重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果顯示,成熟肽基因長(zhǎng)1200bp,編碼399個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為4.67。將測(cè)序結(jié)果與原始序列比對(duì)顯示獲取的轉(zhuǎn)錄本第86位核苷酸由t(胸腺嘧啶)突變成c(胞嘧啶),導(dǎo)致第29個(gè)氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸。將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌rosetta(de3)中經(jīng)iptg誘導(dǎo)后獲得包涵體表達(dá)。westernblotting證實(shí)獲取的重組蛋白是目的蛋白。經(jīng)elisa檢測(cè)獲取的高效價(jià)重組抗體。提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染aa-yc基因的s2細(xì)胞系基因組dna,經(jīng)pcr鑒定并確定建立可穩(wěn)定表達(dá)raa-yc的s2細(xì)胞系。raa-yc的抗凝血作用結(jié)果顯示:raa-yc對(duì)pt、tt與aptt均無延時(shí)效應(yīng);血小板聚集抑制檢測(cè)發(fā)現(xiàn),raa-yc在0.0064-200ng/μl對(duì)adp誘導(dǎo)的血小板聚集均有抑制作用,但在0.16 ng/μl時(shí)抑制作用最強(qiáng),但不呈量-效關(guān)系。結(jié)論:在埃及伊蚊基因組中獲得的12條yellow基因同源性較低,且在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中表達(dá)有差異;埃及伊蚊吸血可調(diào)控Aa-Yc的表達(dá);成功表達(dá)出原核rAa-Yc融合蛋白,并獲取高效價(jià)(1:8000)兔抗rAa-Yc多克隆抗體,且該蛋白具有抑制血小板聚集功能;篩選到真核表達(dá)Aa-Yc的S2穩(wěn)定細(xì)胞系。
【關(guān)鍵詞】：埃及伊蚊 yellow基因家族 表達(dá)譜 Aa-Yc基因 原核表達(dá) 真核表達(dá) 血小板聚集
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R384.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 縮略詞表11-13
• 引言13-14
• 材料與方法14-37
• 結(jié)果37-56
• 討論56-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 附錄65-68
• 綜述68-77
• 參考文獻(xiàn)73-77
• 作者簡(jiǎn)歷77-78
• 致謝78-79
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集79

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本文編號(hào)：581112