本文關(guān)鍵詞：模擬水樣中甲型肝炎病毒濃縮方法的比較研究

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【摘要】：甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus, HAV)引起的急性傳染病,感染者可能出現(xiàn)黃疸、發(fā)熱、厭食、惡心、嘔吐、頭疼和乏力等癥狀。HAV主要通過糞口途徑傳播,有六種基因型,僅有一個血清型,水源性或食源性甲肝爆發(fā)危害人類的健康,因此檢測食物或水中的HAV對食品安全或飲用水安全具有重要意義。由于環(huán)境水體中HAV的含量較少,直接檢測比較困難,細胞培養(yǎng)HAV耗費時間較長,病毒滴度較低,因此,選擇一種合適的物理方法對水樣中HAV進行富集濃縮顯得很重要。本研究分兩個部分：第一部分：比較兩種陰陽離子濾膜對模擬水樣中HAV濃縮效果采用Sartorius陽離子濾膜和Millipore陰離子濾膜過濾濃縮做為一步濃縮方法,聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)沉淀濃縮做為二步濃縮方法對模擬水樣中的HAV進行濃縮,采用TaqMan real-time RT-PCR進行檢測。以加入甲肝減毒活疫苗(Hepatitis A Attenuated Live Vaccine, HepA-L)的超純水或礦泉水為模擬水樣,以不加HepA-L的超純水或礦泉水為陰性對照,采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件,用T檢驗的方法對兩種濾膜的濃縮效果進行統(tǒng)計學分析,結(jié)果表明兩者無統(tǒng)計學差異(Ct值比較P=0.3740.05,病毒量比較P=0.3070.05)。選用Sartorius陽離子濾膜比較不同的濾膜洗脫方式：搖床清洗、渦流清洗、超聲20min清洗、超聲40min清洗、直接裂解的方法對濾膜進行洗脫處理,結(jié)合PEG沉淀二步濃縮對模擬水樣進行濃縮,提取核酸后采用[aqMan Real-Time RT-PCR檢測,采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件,用方差分析的方法對不同的膜洗脫方式濃縮后的Ct值及病毒回收量進行統(tǒng)計學分析比較,結(jié)果表明這幾種洗脫方式有統(tǒng)計學差異(Ct值整體比較P=0.0000.05,病毒量整體比較P=0.0000.05)。兩兩比較結(jié)果表明直接裂解的方式與其他幾種方式均具有統(tǒng)計學差異,且回收率均值高于其他幾種方法,回收率為68.17±16.79%。選用Millipore陰離子濾膜和Sartorius陽離子濾膜用直接裂解的方式對濾膜進行處理,以加入HepA-L的超純水或礦泉水為模擬水樣,濃度分別為0.2TCIDso/m1,1 TCIDso/ml,5 TCIDso/ml,以不加HepA-L的超純水或礦泉水為陰性對照,將濃縮后所得Ct值及病毒量進行統(tǒng)計學分析,結(jié)果顯示兩種濾膜在低病毒濃度時(0.2 TCID50/ml),其回收效率能達到70%以上；兩種模擬礦泉水與相同病毒量的模擬超純水樣中的病毒回收量進行方差分析比較,結(jié)果顯示三者沒有統(tǒng)計學差異(P=0.9500.05),回收率均值大小顯示這三種水質(zhì)濃縮效果相當。小結(jié)：本實驗結(jié)果表明Millipore陰離子濾膜和Sartorius陽離子濾膜在一定病毒量濃度時,兩種濾膜的濃縮效果沒有統(tǒng)計學差異；比較的幾種不同的膜洗脫方式濃縮效果有差異,其中直接裂解的方式濃縮效果優(yōu)于其他幾種方式；比較的不同濃度模擬病毒水樣中,兩種濾膜在低病毒濃度時回收效果均能達到較高的水平,比較的三種水質(zhì)的濃縮效果沒有統(tǒng)計學差異。本研究結(jié)果為后續(xù)水體中HAV濃縮方法的優(yōu)化提供一定的實驗依據(jù)。第二部分：模擬水樣中甲肝病毒超濾濃縮和PEG濃縮方法的比較為比較模擬水樣中甲肝病毒超濾濃縮和PEG濃縮方法,向模擬水樣中接種已知量的甲肝病毒,分別選用Millipore和Sartorius公司的100KD和50KD孔徑的微孔超濾管及終濃度為10%聚乙二醇(PEG)-1M氯化鈉(NaCl)沉淀的方法對模擬水樣進行濃縮,采用熒光定量RT-PCR方法檢測濃縮后的病毒量,用SPSS21.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果顯示同一孔徑不同廠家的超濾管濃縮病毒無統(tǒng)計學差異(P=0.25,P=0.532),對濃縮后的Ct值及回收量進行分組比較,結(jié)果均表明不同處理方法有統(tǒng)計學差異(P=0.0000.05,P=0.0000.05),其中50KD組濃縮病毒回收率為(94.57±16.26%),100KD組濃縮病毒回收率為(52.37±14.75%),10%PEG-1.0MNaCl沉淀病毒回收效率為(63.5±8.45%)。小結(jié)：超濾和PEG沉淀兩種方法均可用于水樣中HAV濃縮,超濾管濃縮病毒操作簡便,耗時更短,選擇合適孔徑可以提高HAV病毒回收率,本實驗中50KD超濾管HAV回收率高于100KD:PEG更適用處理大體積樣本。綜上所述,本研究結(jié)果表明Millipore陰離子濾膜和Sartorius陽離子濾膜均可用于水中HAV的濃縮,在一定病毒濃度時,兩種濾膜的濃縮效果差異無統(tǒng)計學意義,Sartorius陽離子濾膜操作更為簡單；直接裂解的洗脫方式濃縮效果優(yōu)于其他幾種方式；本實驗比較的三種水質(zhì)的濃縮效果差異沒有統(tǒng)計學意義。超濾和PEG沉淀兩種方法均可用于水樣中HAV濃縮,超濾管濃縮病毒操作簡便,耗時更短,選擇合適孔徑可以提高HAV病毒回收率,本實驗中50KD超濾管HAV回收率高于100KD:PEG更適用處理大體積樣本。
【關(guān)鍵詞】：甲型肝炎病毒 濃縮方法 PEG沉淀 直接裂解 超濾
【學位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373.21
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 第一部分 比較兩種陰陽離子濾膜對模擬水樣中HAV濃縮效果13-41
• 前言13-16
• 1. 實驗材料16-18
• 2. 實驗方法18-25
• 3. 實驗結(jié)果25-38
• 4. 實驗討論38-40
• 小結(jié)40-41
• 第二部分 模擬水樣中甲肝病毒超濾濃縮和PEG濃縮方法的比較41-51
• 前言41
• 1. 實驗材料41-42
• 2. 實驗方法42-47
• 3. 實驗結(jié)果47-50
• 4. 實驗討論50-51
• 小結(jié)51
• 全文總結(jié)51-52
• 參考文獻52-54
• 綜述：甲型肝炎病毒水體濃縮方法54-63
• 參考文獻60-63
• 致謝63

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本文編號：576383