本文關(guān)鍵詞：恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域替換對TCR分子功能的影響

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【摘要】：目的:通過探討T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor,TCR)分子的β、α雙鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別被免疫球蛋白IgG的重鏈C1區(qū)和輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域替換后,其激活下游信號分子、活化T細(xì)胞能力的變化情況來確定改造后的TCR是否具有相應(yīng)的生物學(xué)功能,用以證明這種恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域改造策略不僅可以使TCR基因修飾的T細(xì)胞(TCR-T)內(nèi)所產(chǎn)生的外源TCR分子與內(nèi)源TCR分子錯(cuò)配情況減少,而且恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域改造的TCR分子仍然有相應(yīng)的生物學(xué)功能,為改善TCR基因修飾的T細(xì)胞過繼性免疫治療提供借鑒。方法:一、穿梭質(zhì)粒載體pDC315-rβ-IRES-rα的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中把經(jīng)優(yōu)勢取用得到的TCR Vα12.2/Vβ7.1分子的雙鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別替換為IgG的輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域和重鏈C1區(qū),保留了兩條鏈的抗原識別區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)這樣就形成了一種三明治形式的嵌合型TCR分子(chim-TCR),并利用IRES將其進(jìn)行連接實(shí)現(xiàn)雙鏈胞內(nèi)共表達(dá),兩條鏈分別被黃綠色熒光蛋白和青色熒光蛋白標(biāo)記后克隆到pDC315載體上(pDC315-rβYFP-IRES-rαCFP),經(jīng)過FRET分析表明其可以抑制雜合TCR分子的產(chǎn)生。為研究這種嵌合型TCR分子是否和野生型TCR分子一樣具有相應(yīng)的生物學(xué)功能,首先需要去除兩種熒光蛋白,以防止其對rβ、rα功能的影響。我們以載體pDC315-rβYFP-IRES-rαCFP為基礎(chǔ),擴(kuò)增嵌合型TCR分子雙鏈rβ及IRES-rα,通過EcoRI、Nhe I的酶切、連接反應(yīng)構(gòu)建過渡載體pDC315-rβ;然后對pDC315-rβ及IRES-rα進(jìn)行NheI、Sal I雙酶切,并連接為重組嵌合型腺病毒包裝用穿梭質(zhì)粒載體pDC315-rβ-IRES-rα,以進(jìn)行后續(xù)嵌合型TCR分子生物學(xué)功能方面的研究。二、重組嵌合型腺病毒Ad5/F35-rβ-IRES-rα的構(gòu)建利用Lipofectamine 2000將Ad5/F35腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGIoxdeE1Cre與穿梭質(zhì)粒pDC315-rβ-IRES-rα共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,以包裝攜帶嵌合型TCR基因的重組腺病毒載體;將獲得的病毒轉(zhuǎn)染7402細(xì)胞,提取總RNA,通過RT-PCR法獲得c-DNA,以c-DNA為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增來檢測重組嵌合型腺病毒是否構(gòu)建成功;將鑒定正確的重組嵌合型腺病毒大量擴(kuò)增后經(jīng)tcid50法檢測病毒滴度;按照moi=100進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀檢測目的基因在淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況。三、嵌合型tcr分子生物學(xué)功能的鑒定通過免疫印跡法對嵌合型tcr分子轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激信號、活化t細(xì)胞的能力進(jìn)行檢測,所檢測的信號分子包括:pkc、erk、nfat的磷酸化與去磷酸化情況;通過熒光定量pcr對il-2、ifn-γ的表達(dá)水平進(jìn)行分析;通過elisa檢測細(xì)胞因子il-2和ifn-γ的分泌水平。結(jié)果:一、以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的含有嵌合型tcr分子的重組質(zhì)粒pdc315-rβyfp-ires-rαcfp為基礎(chǔ),成功構(gòu)建了含嵌合型tcr基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pdc315-rβ-ires-rα。二、將穿梭質(zhì)粒pdc315-rβ-ires-rα和ad5/f35型腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hek-293細(xì)胞,成功包裝出重組嵌合型tcr腺病毒ad5/f35-rβ-ires-rα;利用rt-pcr在重組嵌合型tcr腺病毒中檢測出目的基因rβ-ires-rα;利用重組嵌合型tcr腺病毒感染淋巴細(xì)胞后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到嵌合型tcr分子的表達(dá)率為10%左右;tcid50法測得擴(kuò)增后的重組嵌合型tcr腺病毒滴度達(dá)到1.3×108iu/ml。三、重組嵌合型腺病毒轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞并行特異抗體刺激,經(jīng)熒光定量pcr、酶聯(lián)免疫吸附法均檢測到細(xì)胞因子ifn-γ的變化較之于未轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞組有顯著性的升高,而il-2只有48小時(shí)的分泌水平于兩組間具有顯著性差異;蛋白免疫印跡檢測到在經(jīng)嵌合型tcr基因轉(zhuǎn)染并接受特異抗體刺激的t淋巴細(xì)胞中,信號分子pkc、erk的磷酸化與去磷酸化情況發(fā)生明顯的變化,而nfat的去磷酸化變化不明顯。結(jié)論:所構(gòu)建的嵌合型tcr分子以腺病毒為載體能成功轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞內(nèi),并得到有效表達(dá);其激活淋巴細(xì)胞、傳遞活化信號至下游信號分子的能力得到有效保留;表明采用igg的輕鏈恒定區(qū)與重鏈c1區(qū)分別替換tcr的α、β鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的策略是可行的,從而為改善tcr基因修飾的t細(xì)胞過繼性免疫治療提供了借鑒。
【關(guān)鍵詞】：嵌合型TCR 重組腺病毒 生物學(xué)功能 影響
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-18
• 第一部分 穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建18-33
• 引言18
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本18
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑18-19
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法20-26
• 1.2.1 rβ 與IRES-rα 的引物設(shè)計(jì)20
• 1.2.2 重組質(zhì)粒載體pDC315-rβ-IRES-rα 的構(gòu)建過程20-21
• 1.2.3 rβ 及IRES-rα 的擴(kuò)增21-22
• 1.2.4 PCR產(chǎn)物的純化22
• 1.2.5 雙酶切pDC315空載體與PCR純化產(chǎn)物rβ22-23
• 1.2.6 雙酶切產(chǎn)物膠回收23
• 1.2.7 pDC315雙酶切片段和rβ 雙酶切片段進(jìn)行連接23-24
• 1.2.8 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化和鑒定24-25
• 1.2.9 去內(nèi)毒素質(zhì)粒pDC315-rβ 的提取25-26
• 1.2.10 IRES-rα 與pDC315-rβ 的雙酶切26
• 1.3 結(jié)果26-29
• 1.3.1 rβ 及rα 的擴(kuò)增26-27
• 1.3.2 pDC315-rβ-IRES-rα 構(gòu)建結(jié)果27-29
• 1.4 討論29-32
• 1.5 結(jié)論32-33
• 第二部分 重組嵌合型腺病毒Ad5/F35的包裝、鑒定與滴度測定33-43
• 引言33
• 2.1 材料33-34
• 2.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和試劑33
• 2.1.2 儀器33-34
• 2.2 方法34-38
• 2.2.1 HEK-293細(xì)胞的培養(yǎng)34
• 2.2.2 Ad5/F35-rβ-IRES-rα 重組腺病毒的包裝34-35
• 2.2.3 重組腺病毒鑒定35-36
• 2.2.4 擴(kuò)大培養(yǎng)重組腺病毒36-37
• 2.2.5 重組腺病毒Ad5/F35-rβ-IRES-rα 的滴度測定37
• 2.2.6 流式細(xì)胞儀檢測重組腺病毒載體在PBMC細(xì)胞的表達(dá)37-38
• 2.3 結(jié)果38-40
• 2.3.1 HEK-293細(xì)胞包裝重組腺病毒38
• 2.3.2 重組嵌合型腺病毒Ad5/F35-rβ-IRES-rα 的鑒定38-40
• 2.4 討論40-42
• 2.5 結(jié)論42-43
• 第三部分 嵌合型TCR分子活化T細(xì)胞能力的檢測43-60
• 引言43
• 3.1 材料43-44
• 3.1.1 試劑43-44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法44-49
• 3.2.1 細(xì)胞分組與實(shí)驗(yàn)處理44
• 3.2.2 Western blot檢測細(xì)胞信號分子PKC、p-Erk、NFAT的磷酸化變化情況44-47
• 3.2.3 熒光定量PCR分析細(xì)胞因子在mRNA水平的變化47-48
• 3.2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定IFN-γ、IL-2 的分泌變化48-49
• 3.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析49
• 3.3 結(jié)果49-54
• 3.3.1 Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)信號分子磷酸化變化結(jié)果49-52
• 3.3.2 IL-2、IFN-γ 在mRNA水平的表達(dá)變化52-53
• 3.3.3 IL-2、IFN-γ 在分泌水平的表達(dá)變化53-54
• 3.4 討論54-59
• 3.5 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 附錄一 英文縮略詞表66-67
• 附錄二 質(zhì)粒圖譜67-68
• 致謝68

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本文編號：534493