發(fā)布時(shí)間：2017-07-03 02:06

  本文關(guān)鍵詞：部分結(jié)扎頸總動(dòng)脈誘導(dǎo)ApoE基因敲除大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型及mTOR的相關(guān)性分析

  更多相關(guān)文章： TALENs ApoE~(-/-)大鼠 動(dòng)脈粥樣硬化 mTOR

【摘要】：研究背景和目的:目前,ApoE~(-/-)小鼠是已成功建立的較好的研究動(dòng)脈粥樣硬化的模型動(dòng)物,然而其牽涉各動(dòng)脈分支的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊分布以及斑塊內(nèi)組成成分與動(dòng)脈粥樣硬化病人有很大程度的不同。并且,考慮到其較小的體型,并不適合血管內(nèi)成形術(shù)、試驗(yàn)新型藥物支架或者新型醫(yī)療裝置。雖然類如小型豬、犬類等大型動(dòng)物當(dāng)前也應(yīng)用于血管移植方面的研究,但其價(jià)格也是不菲的。大鼠在研究心血管疾病方面,特別是高血壓及腦卒中,是優(yōu)秀而且適合的模型動(dòng)物。相對(duì)于小鼠,大鼠的生理狀況也更容易檢測(cè),也更類似于相應(yīng)的人類情況,其大小也更適合血管內(nèi)介入的操作。但目前為止,并沒有適合動(dòng)脈粥樣硬化的大鼠模型。雖然前期不同的研究團(tuán)隊(duì)都嘗試著用不同的誘導(dǎo)方法,去建立動(dòng)脈粥樣硬化模型,但這些結(jié)果仍然是不確定的。飲食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥并不能誘發(fā)大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化,因此普遍認(rèn)為大鼠具有對(duì)高脂的抵抗性,另一個(gè)可能的原因則為高脂誘導(dǎo)的高膽固醇血癥,其血膽固醇水平仍不足以引起動(dòng)脈粥樣硬化。因此,我們嘗試通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技術(shù),構(gòu)建Apo E基因敲除大鼠,給予高膽固醇飲食,誘發(fā)其極高水平的高膽固醇血癥,再采用部分結(jié)扎頸總動(dòng)脈的手術(shù)方式造成紊亂的血流剪切力,導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷,從而建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵分子,而近年來(lái)平滑肌細(xì)胞增殖被認(rèn)為在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和演變中均有重要作用,我們前期研究也發(fā)現(xiàn)mTOR的表達(dá)與小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的負(fù)荷具有相關(guān)性。因此,在本研究中擬進(jìn)一步探討冠心病患者外周血淋巴細(xì)胞mTOR的表達(dá)水平與冠脈狹窄程度的相關(guān)性。研究方法:研究分為兩部分第一部分:ApoE~(-/-)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型建立及評(píng)價(jià)1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及ApoE~(-/-)大鼠的構(gòu)建雄性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組,采用TALENs技術(shù)以SD大鼠為遺傳背景構(gòu)建Apo E敲除大鼠,所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均SPF環(huán)境培養(yǎng),自由取食及飲水。2.高膽固醇飲食飼養(yǎng)將6-8周齡大小雄性SD野生型及ApoE~(-/-)大鼠隨機(jī)分為普通飲食及高膽固醇飲食四組,高膽固醇飲食成分為67.8%基礎(chǔ)飼料,10%豬油,1.5%膽固醇,0.5%膽酸鈉,15%蛋黃粉,0.2%甲硫氧嘧啶,以及1.5%蔗糖。3.ApoE~(-/-)大鼠生理情況測(cè)量經(jīng)過(guò)普通及高膽固醇飲食飼養(yǎng)12周后,測(cè)量每組體重、隨機(jī)血糖、心率、動(dòng)脈血壓。4.血脂及血清炎性因子的測(cè)量檢測(cè)其血清TG水平、TC水平、LDL-c水平、HDL-c水平,ELISA檢測(cè)其腫瘤壞死因子a、白介素1b、白介素6、白介素10水平。5.主動(dòng)脈大體油紅染色6.部分結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈將6-8周齡大小雄性WT及ApoE~(-/-)大鼠經(jīng)過(guò)高膽固醇飲食處理10周后,部分結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈,右側(cè)頸總動(dòng)脈作為對(duì)照,繼續(xù)高膽固醇飲食兩周后取材。7.組織病理分析主動(dòng)脈根部及雙側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色、HE染色、MASSON染色,雙側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行免疫熒光染色(CD31、CD68、a-SMA),以及TUNEL染色。8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR1)檢測(cè)主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1的mRNA表達(dá)情況2)檢測(cè)頸總動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1、mTOR的mRNA表達(dá)情況第二部分:外周血淋巴細(xì)胞mTOR mRNA水平與冠心病患者冠脈病變程度的相關(guān)性分析1.收集臨床冠脈造影陽(yáng)性及陰性結(jié)果患者病例資料2.檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞mTOR mRNA表達(dá)情況3.進(jìn)行相關(guān)臨床指標(biāo)及mTOR與冠狀動(dòng)脈病變程度的相關(guān)性分析結(jié)果:1.成功構(gòu)建ApoE~(-/-)大鼠運(yùn)用TALENs技術(shù)成功構(gòu)建以SD大鼠為遺產(chǎn)背景的ApoE~(-/-)大鼠,基因組DNA測(cè)序結(jié)果顯示其相對(duì)于野生型大鼠,于Apo E基因核心編碼區(qū)缺失14個(gè)堿基對(duì)。2.ApoE~(-/-)大鼠生理情況普通飲食下ApoE~(-/-)大鼠和野生型大鼠體重?zé)o明顯差異,但高膽固醇飲食喂養(yǎng)12周后,兩種基因型大鼠體重均出現(xiàn)顯著的降低(P0.05),而且高膽固醇飲食均造成ApoE~(-/-)大鼠與野生型大鼠隨機(jī)血糖輕微的上升(P0.05)。ApoE~(-/-)大鼠相比野生型大鼠心率血壓并無(wú)明顯變化,說(shuō)明Apo E基因缺陷并未對(duì)心率血壓造成影響,但是高膽固醇飲食卻導(dǎo)致了ApoE~(-/-)大鼠和野生型大鼠心率血壓不同程度的下降(P0.05)。同既往的研究類似,高膽固醇飲食僅僅造成了野生型大鼠TG及LDL-c輕微幅度的升高(P0.01),但卻促成了ApoE~(-/-)大鼠極其顯著的上升(P0.01),形成了典型的血脂紊亂。3.ApoE~(-/-)大鼠對(duì)高膽固醇血癥的抵抗性四組大鼠主動(dòng)脈大體油紅染色均呈陰性結(jié)果,同時(shí),主動(dòng)脈根部HE染色也未發(fā)現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。進(jìn)一步探究原因,四組大鼠ELISA檢測(cè)血清TNF-a、IL-1b、IL-6水平并沒有明顯的較大差異,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示高膽固醇飲食喂養(yǎng)的ApoE~(-/-)大鼠主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1也僅僅是呈數(shù)倍的升高(P0.05)。4.部分結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化高膽固醇飲食背景下,部分結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈兩周后的ApoE~(-/-)大鼠及野生型大鼠HE染色均顯示出大小面積相似的斑塊形成,MASSON染色結(jié)果均提示有少量纖維素沉積,但ORO染色結(jié)果顯示ApoE~(-/-)大鼠斑塊內(nèi)陽(yáng)性,而野生型大鼠則為陰性。免疫熒光染色結(jié)果顯示ApoE~(-/-)大鼠斑塊內(nèi)富集大量的CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞,相比之下,野生型大鼠斑塊內(nèi)則顯示富集大量平滑肌細(xì)胞而無(wú)CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞,另外,ApoE~(-/-)大鼠斑塊內(nèi)有CD31陽(yáng)性的新生血管出現(xiàn),而野生型大鼠則未發(fā)現(xiàn)明顯CD31陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,兩種基因型大鼠與正常右側(cè)頸總動(dòng)脈相比,結(jié)扎側(cè)的頸總動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1、mTOR均有顯著升高(P0.01)。5.兩組患者臨床指標(biāo)的比較冠狀動(dòng)脈病變組的年齡、BMI、TG、TC、LDL-c、Gensini積分與冠狀動(dòng)脈正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而其他因素如性別、民族、心率、血壓、空腹血糖、FFA、ALT、AST、Scr、BUN、UA、HDL-c、Apo A、Apo B、LPA則差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.各臨床指標(biāo)及mTOR mRNA水平及與冠脈狹窄程度的相關(guān)分析全部患者TG、TC、年齡及外周血淋巴細(xì)胞mTOR表達(dá)水平均與冠狀動(dòng)脈病變的Gensini積分成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r分別為0.254、0.236、0.207、0.343,P值均0.01,而LDL、BMI則與冠脈狹窄程度無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論:ApoE~(-/-)大鼠可成為高膽固醇血癥新型模型,通過(guò)部分結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈可建立動(dòng)脈粥樣硬化模型,其mTOR表達(dá)水平顯著升高,臨床回歸性研究可驗(yàn)證患者外周血淋巴細(xì)胞mTOR表達(dá)水平均與冠脈狹窄程度呈正相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：TALENs ApoE~(-/-)大鼠 動(dòng)脈粥樣硬化 mTOR
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543.5;R-332
【目錄】：

• 英文縮略語(yǔ)表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 ApoE~(-/-)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型建立及評(píng)價(jià)16-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-28
• 2.3 結(jié)果28-44
• 2.4 討論44-48
• 第三章 外周血淋巴細(xì)胞mTOR mRNA水平與冠心病患者冠脈病變程度的相關(guān)性分析48-55
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料48-49
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法49-52
• 3.3 結(jié)果52-54
• 3.4 討論54-55
• 全文結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 文獻(xiàn)綜述 基因工程動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型研究進(jìn)展59-66
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文66-67
• 致謝67

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