本文關(guān)鍵詞：永生化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)常見病毒的易感性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)比骨髓來(lái)源的MSCs具有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力、免疫原性低,具有多向分化潛能、安全性好。因此MSCs在再生醫(yī)學(xué)、基因治療、細(xì)胞治療、疫苗生產(chǎn)檢定等方面具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。本課題組前期將人端粒酶催化亞基導(dǎo)入人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs),建立了永生化hMSCs,該細(xì)胞系具有體外定向分化的潛能、保持二倍體核型、表面標(biāo)記符合MSCs特征且在小鼠體內(nèi)無(wú)致瘤性。在此基礎(chǔ)上,本研究檢測(cè)該細(xì)胞系對(duì)痘苗病毒天壇株(VTT)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)、腸道病毒71型(EV71)、重組仙臺(tái)病毒(rSeV-HIVgag)、重組腺病毒(rAd5-GFP、r Ad5F35-GFP)及流感病毒A/California/7/2009(H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)共6大類10個(gè)病毒株的易感性,為該細(xì)胞系的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)中,使用不同劑量的病毒感染hMSCs,同時(shí)用病毒的易感細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照,通過(guò)顯微鏡觀察病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)或報(bào)告基因表達(dá)的綠色熒光蛋白以及間接免疫熒光法檢測(cè)病毒抗原的表達(dá),判斷病毒是否感染hMSCs;在此基礎(chǔ)上,測(cè)定病毒可感染細(xì)胞的最低病毒量;通過(guò)結(jié)晶紫蝕斑法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等來(lái)檢測(cè)和比較感染細(xì)胞釋放的病毒量。結(jié)果顯示:VTT和HCMV感染的hMSCs出現(xiàn)明顯的CPE;rAd5-GFP和rAd5F35-GFP感染的hMSCs可觀察到綠色熒光;間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到VTT、HCMV、r SeV-HIVgag、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)和A/Brisbane/10/2007(H3N2)感染的hMSCs出現(xiàn)明顯的綠色熒光,而EV71、A/California/7/2009(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)感染的hMSCs無(wú)可見的綠色熒光,說(shuō)明hMSCs對(duì)前7個(gè)病毒易感,對(duì)后3個(gè)病毒不易感。最低感染復(fù)數(shù)結(jié)果顯示:VTT、HCMV、rSeV-HIVgag、r Ad5-GFP、rAd5F35-GFP、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)可感染hMSCs的最低MOI分別為1.5×10-5、0.01、5×10-5、150、2、1、5×10-4,而感染其陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞的最低MOI分別為1.5×10-5、2×10-4、5×10-5、5×10-5、2×10-5、0.01、5×10-4。說(shuō)明hMSCs對(duì)不同種類的病毒株易感性差別很大,但其最低感染劑量普遍高于陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞的。對(duì)病毒感染后細(xì)胞釋放的子代病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí),發(fā)現(xiàn)等量VTT感染后48 h、72 h,測(cè)得hMSCs上清中VTT滴度為7.13×103、2.30×105 PFU/m L,而對(duì)照細(xì)胞上清滴度為3.5×105、2.7×106 PFU/mL;等量HCMV感染后4-8 d,測(cè)得hMSCs上清HCMV DNA拷貝數(shù)分別為:3.919、4.240、4.408、4.774、4.730 lgCopies/mL,對(duì)照細(xì)胞的上清拷貝數(shù)分別為4.062、4.069、4.548、6.017、6.904 lgCopies/m L;等量B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)感染后1~3 d,測(cè)得hMSCs上清中病毒HA分別為0、1:2、1:2,而對(duì)照細(xì)胞的上清HA均為1:256。綜上所述,本研究初步研究了永生化hMSCs對(duì)常見6大類病毒中10個(gè)病毒株的易感性,并進(jìn)一步分析比較了可感染的最低病毒量和病毒釋放量,為其在疫苗生產(chǎn)檢定、基因治療、細(xì)胞治療等方面的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：永生化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 病毒感染 易感性
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 主要英文縮寫詞8-12
• 第1章 緒論12-20
• 1.1 研究背景12-17
• 1.1.1 永生化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞12-13
• 1.1.2 常見病毒的概況13-15
• 1.1.3 hMSCs對(duì)病毒易感性的研究進(jìn)展15-17
• 1.2 本文主要研究?jī)?nèi)容及意義17-18
• 1.3 課題研究技術(shù)路線18-20
• 第2章 hMSCs對(duì)VTT的易感性20-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-21
• 2.1.1 病毒和細(xì)胞20
• 2.1.2 主要試劑20
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備20-21
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑的配制21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-23
• 2.2.1 Vero細(xì)胞的復(fù)蘇21
• 2.2.2 Vero細(xì)胞的傳代21-22
• 2.2.3 VTT的擴(kuò)增22
• 2.2.4 VTT的滴定22
• 2.2.5 觀察致細(xì)胞病變效應(yīng)22
• 2.2.6 間接免疫熒光檢測(cè)22-23
• 2.2.7 最低感染復(fù)數(shù)檢測(cè)23
• 2.2.8 感染細(xì)胞釋放病毒的滴度測(cè)定23
• 2.3 結(jié)果23-25
• 2.3.1 VTT擴(kuò)增和滴度測(cè)定23
• 2.3.2 細(xì)胞對(duì)VTT的易感性23-24
• 2.3.3 最低感染復(fù)數(shù)的比較24-25
• 2.3.4 感染細(xì)胞上清中的VTT滴度測(cè)定和比較25
• 2.4 討論25-26
• 2.5 本章小結(jié)26-28
• 第3章 hMSCs對(duì)HCMV的易感性28-46
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料28-29
• 3.1.1 病毒和細(xì)胞28
• 3.1.2 主要試劑28
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備28-29
• 3.1.4 瓊脂糖凝膠制備29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法29-35
• 3.2.1 HCMV Towne毒株的增殖29
• 3.2.2 HCMV滴度測(cè)定29-30
• 3.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察30
• 3.2.4 間接免疫熒光檢測(cè)30-31
• 3.2.5 常規(guī)PCR法檢測(cè)31-32
• 3.2.6 比較最低感染復(fù)數(shù)及CPE32-33
• 3.2.7 感染細(xì)胞上清中HCMV核酸拷貝數(shù)的測(cè)定和比較33-35
• 3.3 結(jié)果35-44
• 3.3.1 HCMV滴定結(jié)果35-36
• 3.3.2 細(xì)胞對(duì)HCMV的易感性36-38
• 3.3.3 HCMV感染的細(xì)胞上清病毒核酸檢測(cè)38-39
• 3.3.4 最低感染復(fù)數(shù)及細(xì)胞毒性的比較39-40
• 3.3.6 感染細(xì)胞上清HCMV核酸拷貝數(shù)測(cè)定和比較40-44
• 3.4 討論44-45
• 3.5 本章小結(jié)45-46
• 第4章 hMSCs對(duì)EV71, rSeV-HIVgag, rAd5-GFP, r Ad5F35-GFP的易感性46-58
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 4.4.1 細(xì)胞46
• 4.4.2 病毒來(lái)源及保存46-47
• 4.4.3 主要試劑47
• 4.4.4 主要儀器設(shè)備47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法47-49
• 4.2.1 病毒擴(kuò)增和滴度測(cè)定47-48
• 4.2.2 永生化hMSCs對(duì)EV71易感性的檢測(cè)48-49
• 4.2.3 永生化hMSCs對(duì)rSeV-HIVgag易感性的檢測(cè)49
• 4.2.4 永生化hMSCs對(duì)rAd5-GFP和r Ad5F35-GFP易感性的檢測(cè)49
• 4.3 結(jié)果49-54
• 4.3.1 病毒滴定結(jié)果49-50
• 4.3.2 hMSCs對(duì)EV71的易感性50-51
• 4.3.3 hMSCs對(duì)r SeV-HIVgag的易感性51-52
• 4.3.4 hMSCs對(duì)rAd5-GFP和r Ad5F35-GFP的易感性52-54
• 4.4 討論54-56
• 4.5 本章小結(jié)56-58
• 第5章 hMSCs對(duì)人流感病毒的易感性研究58-66
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料58-59
• 5.1.1 病毒和細(xì)胞58
• 5.1.2 主要試劑58
• 5.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制58
• 5.1.4 主要儀器設(shè)備58-59
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法59-61
• 5.2.1 病毒的分裝59
• 5.2.2 病毒滴度測(cè)定59-60
• 5.2.3 間接免疫熒光法檢測(cè)60-61
• 5.2.4 病毒感染細(xì)胞上清血凝效價(jià)測(cè)定61
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-63
• 5.3.1 流感病毒滴定結(jié)果61-62
• 5.3.2 流感病毒核蛋白表達(dá)結(jié)果62-63
• 5.3.3 病毒感染細(xì)胞上清血凝效價(jià)測(cè)定結(jié)果63
• 5.4 討論63-64
• 5.5 本章小結(jié)64-66
• 結(jié)論66-68
• 附表68-70
• 參考文獻(xiàn)70-74
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文74-76
• 致謝76

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9 夏勇;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抑制HepG2作用優(yōu)化方法探索[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

10 羅永慧;Pax6對(duì)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用及其應(yīng)用研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2015年

  本文關(guān)鍵詞：永生化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)常見病毒的易感性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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