本文關(guān)鍵詞：永生化人臍帶間充質(zhì)干細胞對常見病毒的易感性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：臍帶間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)比骨髓來源的MSCs具有更強的擴增能力、免疫原性低,具有多向分化潛能、安全性好。因此MSCs在再生醫(yī)學、基因治療、細胞治療、疫苗生產(chǎn)檢定等方面具有廣泛的臨床應用前景。本課題組前期將人端粒酶催化亞基導入人臍帶間充質(zhì)干細胞(hMSCs),建立了永生化hMSCs,該細胞系具有體外定向分化的潛能、保持二倍體核型、表面標記符合MSCs特征且在小鼠體內(nèi)無致瘤性。在此基礎上,本研究檢測該細胞系對痘苗病毒天壇株(VTT)、人巨細胞病毒(HCMV)、腸道病毒71型(EV71)、重組仙臺病毒(rSeV-HIVgag)、重組腺病毒(rAd5-GFP、r Ad5F35-GFP)及流感病毒A/California/7/2009(H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)共6大類10個病毒株的易感性,為該細胞系的進一步應用奠定基礎。在實驗中,使用不同劑量的病毒感染hMSCs,同時用病毒的易感細胞作為陽性對照,通過顯微鏡觀察病毒致細胞病變效應(CPE)或報告基因表達的綠色熒光蛋白以及間接免疫熒光法檢測病毒抗原的表達,判斷病毒是否感染hMSCs;在此基礎上,測定病毒可感染細胞的最低病毒量;通過結(jié)晶紫蝕斑法、實時熒光定量PCR法等來檢測和比較感染細胞釋放的病毒量。結(jié)果顯示:VTT和HCMV感染的hMSCs出現(xiàn)明顯的CPE;rAd5-GFP和rAd5F35-GFP感染的hMSCs可觀察到綠色熒光;間接免疫熒光實驗檢測到VTT、HCMV、r SeV-HIVgag、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)和A/Brisbane/10/2007(H3N2)感染的hMSCs出現(xiàn)明顯的綠色熒光,而EV71、A/California/7/2009(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)感染的hMSCs無可見的綠色熒光,說明hMSCs對前7個病毒易感,對后3個病毒不易感。最低感染復數(shù)結(jié)果顯示:VTT、HCMV、rSeV-HIVgag、r Ad5-GFP、rAd5F35-GFP、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)可感染hMSCs的最低MOI分別為1.5×10-5、0.01、5×10-5、150、2、1、5×10-4,而感染其陽性對照細胞的最低MOI分別為1.5×10-5、2×10-4、5×10-5、5×10-5、2×10-5、0.01、5×10-4。說明hMSCs對不同種類的病毒株易感性差別很大,但其最低感染劑量普遍高于陽性對照細胞的。對病毒感染后細胞釋放的子代病毒進行檢測時,發(fā)現(xiàn)等量VTT感染后48 h、72 h,測得hMSCs上清中VTT滴度為7.13×103、2.30×105 PFU/m L,而對照細胞上清滴度為3.5×105、2.7×106 PFU/mL;等量HCMV感染后4-8 d,測得hMSCs上清HCMV DNA拷貝數(shù)分別為:3.919、4.240、4.408、4.774、4.730 lgCopies/mL,對照細胞的上清拷貝數(shù)分別為4.062、4.069、4.548、6.017、6.904 lgCopies/m L;等量B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)感染后1~3 d,測得hMSCs上清中病毒HA分別為0、1:2、1:2,而對照細胞的上清HA均為1:256。綜上所述,本研究初步研究了永生化hMSCs對常見6大類病毒中10個病毒株的易感性,并進一步分析比較了可感染的最低病毒量和病毒釋放量,為其在疫苗生產(chǎn)檢定、基因治療、細胞治療等方面的應用提供了實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：永生化人臍帶間充質(zhì)干細胞 病毒感染 易感性
【學位授予單位】：北京工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 主要英文縮寫詞8-12
• 第1章 緒論12-20
• 1.1 研究背景12-17
• 1.1.1 永生化人臍帶間充質(zhì)干細胞12-13
• 1.1.2 常見病毒的概況13-15
• 1.1.3 hMSCs對病毒易感性的研究進展15-17
• 1.2 本文主要研究內(nèi)容及意義17-18
• 1.3 課題研究技術(shù)路線18-20
• 第2章 hMSCs對VTT的易感性20-28
• 2.1 實驗材料20-21
• 2.1.1 病毒和細胞20
• 2.1.2 主要試劑20
• 2.1.3 主要儀器設備20-21
• 2.1.4 實驗試劑的配制21
• 2.2 實驗方法21-23
• 2.2.1 Vero細胞的復蘇21
• 2.2.2 Vero細胞的傳代21-22
• 2.2.3 VTT的擴增22
• 2.2.4 VTT的滴定22
• 2.2.5 觀察致細胞病變效應22
• 2.2.6 間接免疫熒光檢測22-23
• 2.2.7 最低感染復數(shù)檢測23
• 2.2.8 感染細胞釋放病毒的滴度測定23
• 2.3 結(jié)果23-25
• 2.3.1 VTT擴增和滴度測定23
• 2.3.2 細胞對VTT的易感性23-24
• 2.3.3 最低感染復數(shù)的比較24-25
• 2.3.4 感染細胞上清中的VTT滴度測定和比較25
• 2.4 討論25-26
• 2.5 本章小結(jié)26-28
• 第3章 hMSCs對HCMV的易感性28-46
• 3.1 實驗材料28-29
• 3.1.1 病毒和細胞28
• 3.1.2 主要試劑28
• 3.1.3 主要儀器設備28-29
• 3.1.4 瓊脂糖凝膠制備29
• 3.2 實驗方法29-35
• 3.2.1 HCMV Towne毒株的增殖29
• 3.2.2 HCMV滴度測定29-30
• 3.2.3 細胞形態(tài)學觀察30
• 3.2.4 間接免疫熒光檢測30-31
• 3.2.5 常規(guī)PCR法檢測31-32
• 3.2.6 比較最低感染復數(shù)及CPE32-33
• 3.2.7 感染細胞上清中HCMV核酸拷貝數(shù)的測定和比較33-35
• 3.3 結(jié)果35-44
• 3.3.1 HCMV滴定結(jié)果35-36
• 3.3.2 細胞對HCMV的易感性36-38
• 3.3.3 HCMV感染的細胞上清病毒核酸檢測38-39
• 3.3.4 最低感染復數(shù)及細胞毒性的比較39-40
• 3.3.6 感染細胞上清HCMV核酸拷貝數(shù)測定和比較40-44
• 3.4 討論44-45
• 3.5 本章小結(jié)45-46
• 第4章 hMSCs對EV71, rSeV-HIVgag, rAd5-GFP, r Ad5F35-GFP的易感性46-58
• 4.1 實驗材料46-47
• 4.4.1 細胞46
• 4.4.2 病毒來源及保存46-47
• 4.4.3 主要試劑47
• 4.4.4 主要儀器設備47
• 4.2 實驗方法47-49
• 4.2.1 病毒擴增和滴度測定47-48
• 4.2.2 永生化hMSCs對EV71易感性的檢測48-49
• 4.2.3 永生化hMSCs對rSeV-HIVgag易感性的檢測49
• 4.2.4 永生化hMSCs對rAd5-GFP和r Ad5F35-GFP易感性的檢測49
• 4.3 結(jié)果49-54
• 4.3.1 病毒滴定結(jié)果49-50
• 4.3.2 hMSCs對EV71的易感性50-51
• 4.3.3 hMSCs對r SeV-HIVgag的易感性51-52
• 4.3.4 hMSCs對rAd5-GFP和r Ad5F35-GFP的易感性52-54
• 4.4 討論54-56
• 4.5 本章小結(jié)56-58
• 第5章 hMSCs對人流感病毒的易感性研究58-66
• 5.1 實驗材料58-59
• 5.1.1 病毒和細胞58
• 5.1.2 主要試劑58
• 5.1.3 主要實驗試劑的配制58
• 5.1.4 主要儀器設備58-59
• 5.2 實驗方法59-61
• 5.2.1 病毒的分裝59
• 5.2.2 病毒滴度測定59-60
• 5.2.3 間接免疫熒光法檢測60-61
• 5.2.4 病毒感染細胞上清血凝效價測定61
• 5.3 實驗結(jié)果61-63
• 5.3.1 流感病毒滴定結(jié)果61-62
• 5.3.2 流感病毒核蛋白表達結(jié)果62-63
• 5.3.3 病毒感染細胞上清血凝效價測定結(jié)果63
• 5.4 討論63-64
• 5.5 本章小結(jié)64-66
• 結(jié)論66-68
• 附表68-70
• 參考文獻70-74
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文74-76
• 致謝76

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