本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲(chóng)核糖核酸酶T2的表達(dá)及其功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的制備重組日本血吸蟲(chóng)核糖核酸酶T2蛋白(rSj RNase T2),并分析其生物學(xué)功能。方法根據(jù)編碼RNase T2開(kāi)放閱讀的基因序列設(shè)計(jì)、合成一對(duì)5′端帶有酶切位點(diǎn)的引物。采用PCR方法從質(zhì)粒CP1412/PEU-GST中擴(kuò)增編碼RNase T2蛋白成熟肽的基因片段,亞克隆到表達(dá)載體pET28a(+)中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒Sj RNase T2-pET28a。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),用鎳螯合親和層析膠在變性條件下純化rSj RNase T2蛋白。純化蛋白通過(guò)尿素濃度梯度透析的方法進(jìn)行復(fù)性,制備可溶性rSj RNase T2。以酵母RNA為底物進(jìn)行消化,采用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)rSj RNase T2酶活性。用純化的rSj RNase T2免疫小鼠,采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清特異抗體水平,觀察其抗原性;采用檢測(cè)Western blot抗rSj RNase T2抗體IgG與成蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)抗原、成蟲(chóng)外分泌抗原、蟲(chóng)卵可溶性抗原和蟲(chóng)卵外分泌抗原的反應(yīng)性,并觀察Sj RNase T2在蟲(chóng)體中的分布。以rSj RNase T2刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7,通過(guò)流式分析觀察RAW264.7細(xì)胞表面標(biāo)志物CD16/32、CD206表達(dá)水平的變化,采用RT-PCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶與精氨酸酶基因mRNA的表達(dá)水平,采用ELISA檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12及IL-10水平的變化,以觀察Sj RNase T2的免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)果重組表達(dá)質(zhì)粒Sj RNase T2-pET28a構(gòu)建成功,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),能表達(dá)重組Sj RNase T2蛋白。該蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)過(guò)復(fù)性能獲得部分可溶性蛋白。rSj RNase T2具有酶活性,能夠水解酵母RNA。ELISA檢測(cè)rSj RNase T2免疫小鼠血清特異性抗體滴度為1，

本文編號(hào)：473613