本文關鍵詞：西尼羅病毒非結構蛋白NS1特異性單克隆抗體的制備及應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：當今,新發(fā)病毒性傳染病不斷出現,我國南方如廣東、廣西、海南等地由于地處熱帶亞熱帶地區(qū),全年平均氣溫高,氣候濕熱,特別適合于各種蟲媒性病原體的繁殖,成為急性蟲媒病毒性傳染性疾病的自然疫源區(qū)和發(fā)生地。西尼羅病毒(West Nile Virus, WNV)屬黃病毒科黃病毒屬中乙型腦炎病毒的血清群[1,21,主要在蚊-鳥-蚊的循環(huán)中進行繁殖,并通過蚊蟲特別是庫蚊傳播給人類,引發(fā)西尼羅熱和西尼羅腦炎。西尼羅熱于1937年首次暴發(fā)于烏干達[3],隨后迅速傳播到非洲、歐洲、美國、加拿大各地,已成為一種嚴重危害人類健康的蚊媒傳播性病毒性傳染病[4]。自1999年,該病毒首次登陸西半球,并迅速肆虐美國,截止2016年1月份,已經有41679例美國居民確診為西尼羅病毒感染,其中,死亡病例高達1753例(http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/westnile/index.htm),是繼炭疽事件之后又一種導致全美恐慌的致病性微生物,被WHO列為當前全球重大流行病之一。近年來,該病毒在全球范圍內仍呈繼續(xù)擴散的趨勢,加拿大、俄羅斯和以色列等國家也相繼出現了人感染而死于西尼羅腦炎的報道。至今,我國雖未有西尼羅熱爆發(fā)流行的報道,但我國擁有11種能夠傳播西尼羅病毒的蚊種。隨著國際貿易和旅游業(yè)的快速及交通的便利,西尼羅病毒傳入我國的危險日益增大。梁國棟等[6-7]通過對2004年和2011年新疆爆發(fā)的乙型腦炎病毒感染患者血清抗體的回歸性分析發(fā)現,其中有部分患者血清中存在針對西尼羅病毒的中和抗體,該結果充分證實了我國已經有西尼羅病毒感染人群的跡象,雖然該病毒尚未在我國引起大規(guī)模爆發(fā)流行,但從西尼羅病毒席卷整個美國的兇險趨勢,西尼羅病毒在中國大規(guī)模爆發(fā)流行是很難避免的。況且,對我國而言,西尼羅病毒是一種全新的致病病毒,全民普遍易感,人群中又沒有免疫屏障,其危險性極大。因此,提前做好防范及相應的技術儲備為我國應對西尼羅病毒的傳入至關重要。然而,目前尚未有安全有效的西尼羅病毒疫苗,臨床上針對西尼羅病毒感染也無有效的抗病毒藥物及治療措施,但近期發(fā)現,在感染早期給予特異性的抗體或者免疫球蛋白對西尼羅病毒感染具有較好的療效[8-10]。因此,建立一種靈敏、特異的早期診斷方法,對早期發(fā)現傳染源,及時治療和阻斷WNV的傳播途徑至關重要。而目前主要應用于西尼羅病毒感染診斷的方法包括核酸檢測、血清學檢測和病毒分離培養(yǎng)。雖然病毒分離培養(yǎng)是診斷西尼羅病毒感染的金標準,但病毒分離需要在三級生物安全實驗室進行,很難達到早期診斷,更不利于基層單位的推廣：RT-PCR等檢測技術相對不穩(wěn)定,受影響因素多,需要昂貴的儀器及熟練技術人員；尤其是WNV感染人類所引發(fā)的病毒血癥期特別短、血中病毒載量也低等特點,容易出現假陰性結果[11-13]。而血清學檢測方法是目前最常用于WNV感染診斷的方法,國際上也有很多基于IgM/IgG的商品化試劑盒,但抗體的產生至少需要3～4天的窗口期,因此僅檢測抗體很難達到早期診斷的目的[14,15]。此外,由于西尼羅病毒與其他黃病毒特別是乙型腦炎病毒抗原存在嚴重交叉反應,很難區(qū)分既往感染或接種乙型腦炎病毒疫苗的患者,進一步限制了其在臨床上的應用。因此,亟需建立一種有效的、特異的西尼羅病毒早期抗原診斷方法。近年兩個基于免疫層析的商品化西尼羅病毒抗原檢測試劑盒被應用于鳥類和蚊類分泌物中病毒抗原的檢測,即VecTest西尼羅病毒E蛋白抗原檢測試劑盒(USA)[17-20]和RAMP西尼羅病毒檢測試劑盒(Canada)但這兩個試劑盒檢測WNV培養(yǎng)上清的敏感性只有105.17 PFU/ml和103.17 PFU/ml,蚊類標本檢測的陽性率也分別只有94%and 65%,這對于病毒載量極低的患者血清來說,這種試劑盒的敏感性完全達不到所需標準。Young[22]和Macdonald[23]發(fā)現在DENV感染患者和WNV感染倉鼠血清中含有高濃度的NS1蛋白,該蛋白是一個高度保守的糖蛋白,是作為黃病毒抗原診斷方法的最佳靶標。Macdonald等和Chung等利用所建立的NS1抗原捕獲ELISA證實了血清中NS1的檢出明顯早于IgM抗體,但由于其方法學的檢測限只有0.5ng/ml,并且只能檢測到病毒感染3天后血清標本中的NS1抗原,很難滿足早期診斷的需求。此外,Macdonald等所建立的基于黃病毒屬交叉型抗體的NS1捕獲ELISA無法區(qū)分西尼羅病毒與其他黃病毒的感染。Saxena等利用西尼羅病毒NS 1特異性單抗和多抗建立的雙抗體夾心檢測方法能夠很好地檢測到WNV感染患者血清中的NS1抗原,同時具有WNV血清型特異性,說明利用抗WNV-NS1抗體建立檢測方法可用于WNV感染的鑒別診斷。但由于該方法使用的捕獲抗體為多克隆抗體,存在批間差異,不利于標準化和商品化。因此,為了建立一種敏感性更高、基于WNV-NS1蛋白的雙單抗夾心抗原檢測方法。本研究通過優(yōu)化WNV-NS1蛋白的表達、純化及復性條件,制備了一組特異性抗WNV-NS1蛋白的單克隆抗體,并對這組單抗的免疫學特性、識別抗原位點及其特異性進行鑒定,利用單抗識別抗原位點的專一性和雙抗體夾心抗原捕獲ELISA的原理,通過對單克隆抗體的優(yōu)化組合,建立雙抗體夾心NS1抗原捕獲的ELISA方法,以期達到早期診斷西尼羅病毒感染的目的。此外,我們對NS1抗體與血小板的交叉反應現象進行了初步研究,為進一步探討NS1蛋白及其抗體在西尼羅病毒發(fā)病機制中的作用奠定基礎。針對我國目前尚未有任何關于西尼羅病毒診斷試劑的這一現狀以及人類目前對西尼羅病毒的發(fā)病機制及其疫苗研制方面的難題,本研究主要通過以下四個部分進行：一、西尼羅病毒NS1蛋白的優(yōu)化表達及抗原性鑒定在前期獲得原核表達pGEX-5X-3/NS1質�；A上,通過對重組西尼羅病毒NS1蛋白的表達條件、純化條件及復性條件的進一步優(yōu)化,成功獲得了高純度、可溶性的重組西尼羅病毒NS1融合蛋白。經Western Blot和間接ELISA鑒定,證實其可與4個血清型登革病毒NS1蛋白交叉性單抗和抗GST特異性單抗反應,具有良好的抗原性,為下一步研究西尼羅病毒免疫診斷試劑奠定基礎。二、西尼羅病毒NS1蛋白血清型特異性單克隆抗體的制備及其鑒定本部分在前期獲得具有良好抗原性和可溶性的WNV-NS1蛋白基礎上,通過細胞融合技術,獲得一組抗西尼羅病毒NS1蛋白特異性的單克隆抗體,并對所獲得單克隆抗體的特異性、免疫學特性及所識別抗原位點的分析。采用重組NS1蛋白對小鼠進行多次皮下和腹腔交替免疫。免疫四次后,取抗體效價高的小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細胞(NS-1)融合,以重組GST蛋白和西尼羅病毒NS1蛋白為包被抗原進行ELISA初篩,免疫熒光(IFA)復測,利用有限稀釋法對復測陽性的細胞株克隆進行亞克隆化,最終獲得65株能夠穩(wěn)定分泌抗NS1蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株。65株單抗的Ig亞類測定顯示IgG1單抗46株,IgG2a單抗8株,IgG2b單抗9株,IgG3單抗2株。IFA和間接ELISA鑒定有26株單抗與4型登革病毒或乙型腦炎病毒有交叉反應；其余的39株單抗均與西尼羅病毒NS1蛋白特異結合,與4個血清型登革病毒、乙型腦炎病毒和黃病毒均無交叉反應,確定為西尼羅病毒血清型特異性。采用單抗間競爭抑制試驗對53株腹水型單抗所識別抗原位點的分析,結果表明,39株WNN-NS1特異性單抗至少識別13個以上不完全相同的抗原位點,14株交叉型單抗至少識別8個以上不完全相同的抗原位點,本部分研究結果為下一步建西尼羅病毒NS1抗原檢測方法提供了必要的奠定基礎。三、西尼羅病毒NSl抗原檢測方法的建立及應用在獲得39株WNV-NS1單抗所識別抗原表位基礎上,根據單抗識別抗原位點的專一性,對39株WNV-NS1蛋白特異性單抗進行組合配對以篩選出最佳的捕獲抗體和檢測抗體組合。即用辣根過氧化物酶對每一株單抗進行標記,以未標記的39株單抗作為捕獲抗體分別與其所識別不同抗原表位的HRP標記的單抗作為檢測抗體進行兩兩組合配對,通過分析檢測NS1蛋白和西尼羅病毒培養(yǎng)上清的敏感性及特異性,并結合正常人血清標本的檢測結果,經多次重復篩選,最終確定了以單抗WNV-M4為捕獲抗體,HRP-WNV-M6為檢測抗體構建檢測體系。該方法檢測重組WNV-NS1蛋白的敏感性為15pg/ml,其線性檢測范圍為15.62到125ng/ml,明顯高于Saxena等報道的0.5ng/ml,可望成為定量分析試劑。該體系的特異性鑒定顯示所建立的雙抗體夾心抗原捕獲法僅特異性的檢測到西尼羅病毒,其檢測限為61pfu/ml,而與黃病毒其他成員如乙型腦炎病毒、登革病毒、黃熱病毒和森林腦炎病毒均無交叉反應。此外,通過對1003例正常人血清標本的檢測確定了方法學的臨界值,并以此標準對107份采集自2006年廣東省登革熱流行區(qū)確診為Ⅰ型登革病毒感染且DV1-NS1抗原陽性的患者血清進行檢測,無一陽性反應。對WNV感染小鼠血清檢測中發(fā)現,本體系能檢測到病毒感染第1天小鼠血清中的NS1蛋白,且隨著感染時間的延長,NS1蛋白的濃度逐漸升高,在感染第4天達到高峰,隨后逐漸降低,第6天NS1蛋白的含量已明顯降低,該結果與Chung等的研究結果一致。尤其是對病毒感染第1-4天小鼠血清中NS1蛋白的檢出率由85.7%升至5-7天的100%,對于病毒感染7天內小鼠血清標本檢測的敏感性明顯高于實時RT-PCR檢測方法(P=0.035)。以上結果表明本研究所建立的方法不僅具有西尼羅病毒血清型特異性,同時能夠檢測到感染第1天到第7天小鼠血清中的NS1蛋白,有望成為西尼羅病毒感染早期診斷的工具。四、抗西尼羅病毒NSl抗體與血小板的交叉反應初探已知同屬黃病毒的登革病毒感染可出現血小板減少及出血熱,且與抗NS1抗體有關。而近年也有兩例西尼羅病毒患者出現重癥出血的報道,但目前國內外尚未見到有關抗西尼羅病毒NS1抗體結合血小板或影響血小板功能的報道�？紤]到西尼羅病毒NS1蛋白與登革病毒NS1蛋白具有高度同源性,那么是否西尼羅NS1單抗也能結合血小板并影響其功能?據此,我們通過間接ELISA\流式細胞術和免疫印跡分別對所獲得的51株NS1單抗與血小板的結合情況做了相關鑒定,結果顯示,51株單抗中間接ELISA檢測與血小板結合的單抗有16株,流式細胞術陽性的單抗有19株,ELISA和流式同時陽性的12株,免疫印跡法鑒定ELISA和流式同時陽性的12株單抗和2株單獨流式陽性的單抗與血小板蛋白的結合則只有8株單抗有陽性反應條帶,其他6株單抗均為陰性,推測該6株單抗識別的可能是構象型表位的血小板蛋白,以至于無法與加熱變性后的血小板蛋白成分結合。本部分研究結果將為進一步揭示NS1蛋白及其抗體在WNV發(fā)病機制及疫苗研發(fā)等提供理論依據。綜上,本研究成功制備了具有良好抗原性和可溶性的重組西尼羅病毒NS1蛋白,并以該重組蛋白作為免疫原免疫小鼠獲得了65株具有NS1蛋白特異性的單克隆抗體,經間接ELISA和IFA鑒定,其中39株為西尼羅病毒NS1蛋白特異性單抗,26株單抗分別與4個血清型登革病毒和乙型腦炎病毒存在不同程度的交叉反應。利用以上獲得的39株WNV-NS1特異性單抗進行配對篩選建立了雙抗體夾心抗原捕獲ELISA法,該方法不僅能檢測到急性期小鼠血中的NS1蛋白,而與黃病毒屬其他成員如乙型腦炎病毒、4個血清型登革病毒、森林腦炎病毒及黃熱病毒均無交叉反應；可在感染第1-7天檢出NS1蛋白,適用于西尼羅病毒感染的早期診斷。與國外同類研究比較本體系敏感性高,檢出時間早,覆蓋感染后時間范圍長,有望應用于西尼羅病毒的早期診斷及鑒別診斷。此外,初步鑒定了部分西尼羅病毒NS1單抗與人血小板的反應性,為研究NS1抗體在WNV感染發(fā)病機制中的作用及制定疫苗研制策略提供理論依據與參考。
【關鍵詞】：西尼羅病毒 非結構蛋白1 單克隆抗體 酶聯免疫吸附試驗 血小板反應性
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-18
• 第一章 西尼羅病毒重組NS1蛋白的表達及抗原性鑒定18-31
• 1.1 材料和方法18-26
• 1.2 結果26-29
• 1.3 討論29-31
• 第二章 西尼羅病毒NS1蛋白特異性單克隆抗體的制備及鑒定31-52
• 2.1 材料和方法31-39
• 2.2 結果39-50
• 2.3 討論50-52
• 第三章 WNV-NS1蛋白檢測方法的建立與優(yōu)化52-64
• 3.1 材料和方法52-56
• 3.2 結果56-61
• 3.3 討論61-64
• 第四章 抗西尼羅病毒NS1抗體與血小板的交叉反應初探64-77
• 4.1 材料和方法65-70
• 4.2 結果70-74
• 4.3 討論74-77
• 參考文獻77-82
• 中英文縮略82-84
• 在讀期間發(fā)表及待發(fā)表的文章84-86
• 在讀期間所獲獎勵及支助86-87
• 致謝87-88

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