本文關(guān)鍵詞：西尼羅病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1特異性單克隆抗體的制備及應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：當(dāng)今,新發(fā)病毒性傳染病不斷出現(xiàn),我國(guó)南方如廣東、廣西、海南等地由于地處熱帶亞熱帶地區(qū),全年平均氣溫高,氣候濕熱,特別適合于各種蟲媒性病原體的繁殖,成為急性蟲媒病毒性傳染性疾病的自然疫源區(qū)和發(fā)生地。西尼羅病毒(West Nile Virus, WNV)屬黃病毒科黃病毒屬中乙型腦炎病毒的血清群[1,21,主要在蚊-鳥-蚊的循環(huán)中進(jìn)行繁殖,并通過(guò)蚊蟲特別是庫(kù)蚊傳播給人類,引發(fā)西尼羅熱和西尼羅腦炎。西尼羅熱于1937年首次暴發(fā)于烏干達(dá)[3],隨后迅速傳播到非洲、歐洲、美國(guó)、加拿大各地,已成為一種嚴(yán)重危害人類健康的蚊媒傳播性病毒性傳染病[4]。自1999年,該病毒首次登陸西半球,并迅速肆虐美國(guó),截止2016年1月份,已經(jīng)有41679例美國(guó)居民確診為西尼羅病毒感染,其中,死亡病例高達(dá)1753例(http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/westnile/index.htm),是繼炭疽事件之后又一種導(dǎo)致全美恐慌的致病性微生物,被WHO列為當(dāng)前全球重大流行病之一。近年來(lái),該病毒在全球范圍內(nèi)仍呈繼續(xù)擴(kuò)散的趨勢(shì),加拿大、俄羅斯和以色列等國(guó)家也相繼出現(xiàn)了人感染而死于西尼羅腦炎的報(bào)道。至今,我國(guó)雖未有西尼羅熱爆發(fā)流行的報(bào)道,但我國(guó)擁有11種能夠傳播西尼羅病毒的蚊種。隨著國(guó)際貿(mào)易和旅游業(yè)的快速及交通的便利,西尼羅病毒傳入我國(guó)的危險(xiǎn)日益增大。梁國(guó)棟等[6-7]通過(guò)對(duì)2004年和2011年新疆爆發(fā)的乙型腦炎病毒感染患者血清抗體的回歸性分析發(fā)現(xiàn),其中有部分患者血清中存在針對(duì)西尼羅病毒的中和抗體,該結(jié)果充分證實(shí)了我國(guó)已經(jīng)有西尼羅病毒感染人群的跡象,雖然該病毒尚未在我國(guó)引起大規(guī)模爆發(fā)流行,但從西尼羅病毒席卷整個(gè)美國(guó)的兇險(xiǎn)趨勢(shì),西尼羅病毒在中國(guó)大規(guī)模爆發(fā)流行是很難避免的。況且,對(duì)我國(guó)而言,西尼羅病毒是一種全新的致病病毒,全民普遍易感,人群中又沒有免疫屏障,其危險(xiǎn)性極大。因此,提前做好防范及相應(yīng)的技術(shù)儲(chǔ)備為我國(guó)應(yīng)對(duì)西尼羅病毒的傳入至關(guān)重要。然而,目前尚未有安全有效的西尼羅病毒疫苗,臨床上針對(duì)西尼羅病毒感染也無(wú)有效的抗病毒藥物及治療措施,但近期發(fā)現(xiàn),在感染早期給予特異性的抗體或者免疫球蛋白對(duì)西尼羅病毒感染具有較好的療效[8-10]。因此,建立一種靈敏、特異的早期診斷方法,對(duì)早期發(fā)現(xiàn)傳染源,及時(shí)治療和阻斷WNV的傳播途徑至關(guān)重要。而目前主要應(yīng)用于西尼羅病毒感染診斷的方法包括核酸檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和病毒分離培養(yǎng)。雖然病毒分離培養(yǎng)是診斷西尼羅病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn),但病毒分離需要在三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,很難達(dá)到早期診斷,更不利于基層單位的推廣：RT-PCR等檢測(cè)技術(shù)相對(duì)不穩(wěn)定,受影響因素多,需要昂貴的儀器及熟練技術(shù)人員；尤其是WNV感染人類所引發(fā)的病毒血癥期特別短、血中病毒載量也低等特點(diǎn),容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[11-13]。而血清學(xué)檢測(cè)方法是目前最常用于WNV感染診斷的方法,國(guó)際上也有很多基于IgM/IgG的商品化試劑盒,但抗體的產(chǎn)生至少需要3～4天的窗口期,因此僅檢測(cè)抗體很難達(dá)到早期診斷的目的[14,15]。此外,由于西尼羅病毒與其他黃病毒特別是乙型腦炎病毒抗原存在嚴(yán)重交叉反應(yīng),很難區(qū)分既往感染或接種乙型腦炎病毒疫苗的患者,進(jìn)一步限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此,亟需建立一種有效的、特異的西尼羅病毒早期抗原診斷方法。近年兩個(gè)基于免疫層析的商品化西尼羅病毒抗原檢測(cè)試劑盒被應(yīng)用于鳥類和蚊類分泌物中病毒抗原的檢測(cè),即VecTest西尼羅病毒E蛋白抗原檢測(cè)試劑盒(USA)[17-20]和RAMP西尼羅病毒檢測(cè)試劑盒(Canada)但這兩個(gè)試劑盒檢測(cè)WNV培養(yǎng)上清的敏感性只有105.17 PFU/ml和103.17 PFU/ml,蚊類標(biāo)本檢測(cè)的陽(yáng)性率也分別只有94%and 65%,這對(duì)于病毒載量極低的患者血清來(lái)說(shuō),這種試劑盒的敏感性完全達(dá)不到所需標(biāo)準(zhǔn)。Young[22]和Macdonald[23]發(fā)現(xiàn)在DENV感染患者和WNV感染倉(cāng)鼠血清中含有高濃度的NS1蛋白,該蛋白是一個(gè)高度保守的糖蛋白,是作為黃病毒抗原診斷方法的最佳靶標(biāo)。Macdonald等和Chung等利用所建立的NS1抗原捕獲ELISA證實(shí)了血清中NS1的檢出明顯早于IgM抗體,但由于其方法學(xué)的檢測(cè)限只有0.5ng/ml,并且只能檢測(cè)到病毒感染3天后血清標(biāo)本中的NS1抗原,很難滿足早期診斷的需求。此外,Macdonald等所建立的基于黃病毒屬交叉型抗體的NS1捕獲ELISA無(wú)法區(qū)分西尼羅病毒與其他黃病毒的感染。Saxena等利用西尼羅病毒NS 1特異性單抗和多抗建立的雙抗體夾心檢測(cè)方法能夠很好地檢測(cè)到WNV感染患者血清中的NS1抗原,同時(shí)具有WNV血清型特異性,說(shuō)明利用抗WNV-NS1抗體建立檢測(cè)方法可用于WNV感染的鑒別診斷。但由于該方法使用的捕獲抗體為多克隆抗體,存在批間差異,不利于標(biāo)準(zhǔn)化和商品化。因此,為了建立一種敏感性更高、基于WNV-NS1蛋白的雙單抗夾心抗原檢測(cè)方法。本研究通過(guò)優(yōu)化WNV-NS1蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性條件,制備了一組特異性抗WNV-NS1蛋白的單克隆抗體,并對(duì)這組單抗的免疫學(xué)特性、識(shí)別抗原位點(diǎn)及其特異性進(jìn)行鑒定,利用單抗識(shí)別抗原位點(diǎn)的專一性和雙抗體夾心抗原捕獲ELISA的原理,通過(guò)對(duì)單克隆抗體的優(yōu)化組合,建立雙抗體夾心NS1抗原捕獲的ELISA方法,以期達(dá)到早期診斷西尼羅病毒感染的目的。此外,我們對(duì)NS1抗體與血小板的交叉反應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)行了初步研究,為進(jìn)一步探討NS1蛋白及其抗體在西尼羅病毒發(fā)病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。針對(duì)我國(guó)目前尚未有任何關(guān)于西尼羅病毒診斷試劑的這一現(xiàn)狀以及人類目前對(duì)西尼羅病毒的發(fā)病機(jī)制及其疫苗研制方面的難題,本研究主要通過(guò)以下四個(gè)部分進(jìn)行：一、西尼羅病毒NS1蛋白的優(yōu)化表達(dá)及抗原性鑒定在前期獲得原核表達(dá)pGEX-5X-3/NS1質(zhì)�；A(chǔ)上,通過(guò)對(duì)重組西尼羅病毒NS1蛋白的表達(dá)條件、純化條件及復(fù)性條件的進(jìn)一步優(yōu)化,成功獲得了高純度、可溶性的重組西尼羅病毒NS1融合蛋白。經(jīng)Western Blot和間接ELISA鑒定,證實(shí)其可與4個(gè)血清型登革病毒NS1蛋白交叉性單抗和抗GST特異性單抗反應(yīng),具有良好的抗原性,為下一步研究西尼羅病毒免疫診斷試劑奠定基礎(chǔ)。二、西尼羅病毒NS1蛋白血清型特異性單克隆抗體的制備及其鑒定本部分在前期獲得具有良好抗原性和可溶性的WNV-NS1蛋白基礎(chǔ)上,通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù),獲得一組抗西尼羅病毒NS1蛋白特異性的單克隆抗體,并對(duì)所獲得單克隆抗體的特異性、免疫學(xué)特性及所識(shí)別抗原位點(diǎn)的分析。采用重組NS1蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行多次皮下和腹腔交替免疫。免疫四次后,取抗體效價(jià)高的小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(NS-1)融合,以重組GST蛋白和西尼羅病毒NS1蛋白為包被抗原進(jìn)行ELISA初篩,免疫熒光(IFA)復(fù)測(cè),利用有限稀釋法對(duì)復(fù)測(cè)陽(yáng)性的細(xì)胞株克隆進(jìn)行亞克隆化,最終獲得65株能夠穩(wěn)定分泌抗NS1蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。65株單抗的Ig亞類測(cè)定顯示IgG1單抗46株,IgG2a單抗8株,IgG2b單抗9株,IgG3單抗2株。IFA和間接ELISA鑒定有26株單抗與4型登革病毒或乙型腦炎病毒有交叉反應(yīng)；其余的39株單抗均與西尼羅病毒NS1蛋白特異結(jié)合,與4個(gè)血清型登革病毒、乙型腦炎病毒和黃病毒均無(wú)交叉反應(yīng),確定為西尼羅病毒血清型特異性。采用單抗間競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)對(duì)53株腹水型單抗所識(shí)別抗原位點(diǎn)的分析,結(jié)果表明,39株WNN-NS1特異性單抗至少識(shí)別13個(gè)以上不完全相同的抗原位點(diǎn),14株交叉型單抗至少識(shí)別8個(gè)以上不完全相同的抗原位點(diǎn),本部分研究結(jié)果為下一步建西尼羅病毒NS1抗原檢測(cè)方法提供了必要的奠定基礎(chǔ)。三、西尼羅病毒NSl抗原檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用在獲得39株WNV-NS1單抗所識(shí)別抗原表位基礎(chǔ)上,根據(jù)單抗識(shí)別抗原位點(diǎn)的專一性,對(duì)39株WNV-NS1蛋白特異性單抗進(jìn)行組合配對(duì)以篩選出最佳的捕獲抗體和檢測(cè)抗體組合。即用辣根過(guò)氧化物酶對(duì)每一株單抗進(jìn)行標(biāo)記,以未標(biāo)記的39株單抗作為捕獲抗體分別與其所識(shí)別不同抗原表位的HRP標(biāo)記的單抗作為檢測(cè)抗體進(jìn)行兩兩組合配對(duì),通過(guò)分析檢測(cè)NS1蛋白和西尼羅病毒培養(yǎng)上清的敏感性及特異性,并結(jié)合正常人血清標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果,經(jīng)多次重復(fù)篩選,最終確定了以單抗WNV-M4為捕獲抗體,HRP-WNV-M6為檢測(cè)抗體構(gòu)建檢測(cè)體系。該方法檢測(cè)重組WNV-NS1蛋白的敏感性為15pg/ml,其線性檢測(cè)范圍為15.62到125ng/ml,明顯高于Saxena等報(bào)道的0.5ng/ml,可望成為定量分析試劑。該體系的特異性鑒定顯示所建立的雙抗體夾心抗原捕獲法僅特異性的檢測(cè)到西尼羅病毒,其檢測(cè)限為61pfu/ml,而與黃病毒其他成員如乙型腦炎病毒、登革病毒、黃熱病毒和森林腦炎病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。此外,通過(guò)對(duì)1003例正常人血清標(biāo)本的檢測(cè)確定了方法學(xué)的臨界值,并以此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)107份采集自2006年廣東省登革熱流行區(qū)確診為Ⅰ型登革病毒感染且DV1-NS1抗原陽(yáng)性的患者血清進(jìn)行檢測(cè),無(wú)一陽(yáng)性反應(yīng)。對(duì)WNV感染小鼠血清檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),本體系能檢測(cè)到病毒感染第1天小鼠血清中的NS1蛋白,且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),NS1蛋白的濃度逐漸升高,在感染第4天達(dá)到高峰,隨后逐漸降低,第6天NS1蛋白的含量已明顯降低,該結(jié)果與Chung等的研究結(jié)果一致。尤其是對(duì)病毒感染第1-4天小鼠血清中NS1蛋白的檢出率由85.7%升至5-7天的100%,對(duì)于病毒感染7天內(nèi)小鼠血清標(biāo)本檢測(cè)的敏感性明顯高于實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)方法(P=0.035)。以上結(jié)果表明本研究所建立的方法不僅具有西尼羅病毒血清型特異性,同時(shí)能夠檢測(cè)到感染第1天到第7天小鼠血清中的NS1蛋白,有望成為西尼羅病毒感染早期診斷的工具。四、抗西尼羅病毒NSl抗體與血小板的交叉反應(yīng)初探已知同屬黃病毒的登革病毒感染可出現(xiàn)血小板減少及出血熱,且與抗NS1抗體有關(guān)。而近年也有兩例西尼羅病毒患者出現(xiàn)重癥出血的報(bào)道,但目前國(guó)內(nèi)外尚未見到有關(guān)抗西尼羅病毒NS1抗體結(jié)合血小板或影響血小板功能的報(bào)道�？紤]到西尼羅病毒NS1蛋白與登革病毒NS1蛋白具有高度同源性,那么是否西尼羅NS1單抗也能結(jié)合血小板并影響其功能?據(jù)此,我們通過(guò)間接ELISA\流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡分別對(duì)所獲得的51株NS1單抗與血小板的結(jié)合情況做了相關(guān)鑒定,結(jié)果顯示,51株單抗中間接ELISA檢測(cè)與血小板結(jié)合的單抗有16株,流式細(xì)胞術(shù)陽(yáng)性的單抗有19株,ELISA和流式同時(shí)陽(yáng)性的12株,免疫印跡法鑒定ELISA和流式同時(shí)陽(yáng)性的12株單抗和2株單獨(dú)流式陽(yáng)性的單抗與血小板蛋白的結(jié)合則只有8株單抗有陽(yáng)性反應(yīng)條帶,其他6株單抗均為陰性,推測(cè)該6株單抗識(shí)別的可能是構(gòu)象型表位的血小板蛋白,以至于無(wú)法與加熱變性后的血小板蛋白成分結(jié)合。本部分研究結(jié)果將為進(jìn)一步揭示NS1蛋白及其抗體在WNV發(fā)病機(jī)制及疫苗研發(fā)等提供理論依據(jù)。綜上,本研究成功制備了具有良好抗原性和可溶性的重組西尼羅病毒NS1蛋白,并以該重組蛋白作為免疫原免疫小鼠獲得了65株具有NS1蛋白特異性的單克隆抗體,經(jīng)間接ELISA和IFA鑒定,其中39株為西尼羅病毒NS1蛋白特異性單抗,26株單抗分別與4個(gè)血清型登革病毒和乙型腦炎病毒存在不同程度的交叉反應(yīng)。利用以上獲得的39株WNV-NS1特異性單抗進(jìn)行配對(duì)篩選建立了雙抗體夾心抗原捕獲ELISA法,該方法不僅能檢測(cè)到急性期小鼠血中的NS1蛋白,而與黃病毒屬其他成員如乙型腦炎病毒、4個(gè)血清型登革病毒、森林腦炎病毒及黃熱病毒均無(wú)交叉反應(yīng)；可在感染第1-7天檢出NS1蛋白,適用于西尼羅病毒感染的早期診斷。與國(guó)外同類研究比較本體系敏感性高,檢出時(shí)間早,覆蓋感染后時(shí)間范圍長(zhǎng),有望應(yīng)用于西尼羅病毒的早期診斷及鑒別診斷。此外,初步鑒定了部分西尼羅病毒NS1單抗與人血小板的反應(yīng)性,為研究NS1抗體在WNV感染發(fā)病機(jī)制中的作用及制定疫苗研制策略提供理論依據(jù)與參考。
【關(guān)鍵詞】：西尼羅病毒 非結(jié)構(gòu)蛋白1 單克隆抗體 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 血小板反應(yīng)性
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-18
• 第一章 西尼羅病毒重組NS1蛋白的表達(dá)及抗原性鑒定18-31
• 1.1 材料和方法18-26
• 1.2 結(jié)果26-29
• 1.3 討論29-31
• 第二章 西尼羅病毒NS1蛋白特異性單克隆抗體的制備及鑒定31-52
• 2.1 材料和方法31-39
• 2.2 結(jié)果39-50
• 2.3 討論50-52
• 第三章 WNV-NS1蛋白檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化52-64
• 3.1 材料和方法52-56
• 3.2 結(jié)果56-61
• 3.3 討論61-64
• 第四章 抗西尼羅病毒NS1抗體與血小板的交叉反應(yīng)初探64-77
• 4.1 材料和方法65-70
• 4.2 結(jié)果70-74
• 4.3 討論74-77
• 參考文獻(xiàn)77-82
• 中英文縮略82-84
• 在讀期間發(fā)表及待發(fā)表的文章84-86
• 在讀期間所獲獎(jiǎng)勵(lì)及支助86-87
• 致謝87-88

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10 駐華盛頓記者 夏曉陽(yáng);美國(guó)暴發(fā)同期最嚴(yán)重西尼羅疫情[N];文匯報(bào);2012年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 姜淑芳;中國(guó)重要庫(kù)蚊屬蚊蟲傳播西尼羅病毒的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

2 劉志國(guó);西尼羅病毒多表位疫苗研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

3 張曉龍;蚊—鳥—蚊循環(huán)在西尼羅病毒傳播中的作用研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

4 史利軍;西尼羅病毒核酸及抗體檢測(cè)體系的建立與評(píng)價(jià)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

5 李曉峰;西尼羅病毒Chin-01株5’非編碼區(qū)與病毒復(fù)制相關(guān)蛋白的相互作用研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

6 張映梅;我國(guó)白紋伊蚊和埃及伊蚊傳播西尼羅病毒的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

7 孫恩成;西尼羅病毒NS1蛋白對(duì)乙型腦炎病毒交叉保護(hù)作用研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 郭立平;穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒prM-E蛋白細(xì)胞系的構(gòu)建[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 楊潔;表達(dá)西尼羅病毒囊膜糖蛋白prM/E重組新城疫病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 曹增國(guó);西尼羅病毒快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

4 丁細(xì)霞;西尼羅病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1特異性單克隆抗體的制備及應(yīng)用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

5 王玉春;西尼羅病毒免疫診斷方法的建立及對(duì)入境人員的血清調(diào)查[D];河南師范大學(xué);2014年

6 曹飛;西尼羅病毒DNA形式復(fù)制子的構(gòu)建及免疫原性研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

7 孫后超;西尼羅病毒E蛋白Ⅲ區(qū)的原核表達(dá)及其對(duì)西尼羅病毒感染的免疫保護(hù)作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

8 寧北芳;乙腦病毒和西尼羅病毒單克隆抗體的制備及鑒定[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

9 張翠云;西尼羅病毒E蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建以及對(duì)小鼠的免疫原性[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 廖玉學(xué);湖南省部分地區(qū)蝙蝠攜帶某些蚊媒病毒的調(diào)查研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

  本文關(guān)鍵詞：西尼羅病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1特異性單克隆抗體的制備及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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