本文關(guān)鍵詞：PD-L1高表達(dá)的大鼠髓源性樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell,DC)是目前公認(rèn)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cells,APCs),它在特異性免疫應(yīng)答的激發(fā)和調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性的作用[1,2]。DC主要由骨髓多能干細(xì)胞的髓系前體—骨髓單個核細(xì)胞(Bone Marrow Mononuclear Cell,BMMC)分化而來[3,4]。在機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中,DC正是通過調(diào)節(jié)其正性或負(fù)性共刺激分子與粘附分子的表達(dá)(即協(xié)同刺激信號),調(diào)控機(jī)體在接受抗原刺激后,是發(fā)生特異性免疫反應(yīng)還是誘導(dǎo)免疫耐受。PD-L1/PD-1(Program Death 1,PD-1;Program Death Ligand 1,PD-L1)作為外周免疫耐受中最重要的負(fù)性共刺激信號通路之一,在器官移植術(shù)后移植物的免疫排斥與耐受的調(diào)節(jié)過程中起著重要作用[5]。本實驗通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)的“雞尾酒”培養(yǎng)法誘導(dǎo)大鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞(Myeloid-derived Dendritic Cell,MDDC)高表達(dá)負(fù)性共刺激分子PD-L1,獲得PD-L1高表達(dá)的樹突狀細(xì)胞,即PD-L1highDC。同時,探索其體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的最適宜條件,構(gòu)建高效、實用的免疫耐受性DC,并對其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分子表型和功能鑒定。雖然大鼠MDDC的培養(yǎng)方法已經(jīng)比較成熟,但如何有效地誘導(dǎo)其高表達(dá)負(fù)性共刺激分子PD-L1,國內(nèi)外研究甚少,我們成功地探索出一條細(xì)胞因子“雞尾酒”培養(yǎng)刺激方法,獲得PD-L1highDC,為體內(nèi)誘導(dǎo)移植免疫耐受研究打下了扎實地基礎(chǔ)。目的:探索一種簡單高效的PD-L1high DC誘導(dǎo)培養(yǎng)方法,為經(jīng)由PD-L1/PD-1負(fù)性共刺激信號通路誘導(dǎo)抗原特異性的移植免疫耐受的體內(nèi)實驗研究打下基礎(chǔ)。方法： 1.實驗分組如下:GM-CSF誘導(dǎo)組、經(jīng)典DC誘導(dǎo)組、“雞尾酒”法誘導(dǎo)組。無菌技術(shù)收集大鼠骨髓細(xì)胞,密度梯度離心法純化獲得BMMC,“雞尾酒”培養(yǎng)法添加細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4、IFN-γ誘導(dǎo)、培養(yǎng)DC,第8天加入LPS促其成熟。2.培養(yǎng)期間,倒置顯微鏡觀察DC的生長狀態(tài),相差顯微鏡和掃描電鏡拍照記錄其形態(tài)學(xué)特征。收集成熟DC,流式細(xì)胞儀檢測鑒定其表面分子標(biāo)記物表達(dá)情況;同種異體的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR)鑒定其細(xì)胞生物學(xué)功能。結(jié)果： 1.各均能成功誘導(dǎo)獲得典型的DC,且各組DC細(xì)胞的形態(tài)學(xué)上無明顯差別。經(jīng)典DC誘導(dǎo)組和“雞尾酒”法誘導(dǎo)組DC的產(chǎn)量和純度均在80%以上,并且在“雞尾酒”法誘導(dǎo)組中,10ng/m L的IFN-γ濃度為誘導(dǎo)收獲高純度PD-L1highDC的最適宜濃度。2.DC表面分子流式鑒定顯示:經(jīng)典DC與PD-L1highDC相比,DC特征性表面分子MHC-Ⅱ(68.86±3.46 VS 20.34±1.71)%、PD-L1(2.00±0.36VS 82.26±6.43)%有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.001)。3.MLR顯示:PD-L1highDC與經(jīng)典DC細(xì)胞相比,其刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力明顯降低,兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論： 1.“雞尾酒”誘導(dǎo)法(即GM-CSF+IL-4聯(lián)合IFN-γ)可成功誘導(dǎo)收獲大量高表達(dá)PD-L1的DC,與經(jīng)典DC對比,在形態(tài)學(xué)上無明顯差別。2.“雞尾酒”法誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,10ng/m L的IFN-γ濃度為誘導(dǎo)、培養(yǎng)高純度PD-L1highDC的最適宜濃度。3.與經(jīng)典DC對比,PD-L1highDC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力顯著下降,顯示出其抑制性DC的細(xì)胞生物學(xué)特性。4.PD-L1highDC表面MHC-Ⅱ表達(dá)與經(jīng)典DC對比,存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異,推測MHC-Ⅱ表達(dá)下調(diào)是PD-L1highDC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力顯著下降的原因之一。5.本實驗探索出了一條簡單高效的PD-L1high DC誘導(dǎo)培養(yǎng)方法,為經(jīng)由PD-L1/PD-1負(fù)性共刺激信號通路誘導(dǎo)抗原特異性的移植免疫耐受的體內(nèi)實驗研究打下基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：樹突狀細(xì)胞 PD-L1 PD-1 免疫耐受 器官移植
【學(xué)位授予單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392.4;Q813
【目錄】：

• 致謝4-6
• 摘要6-9
• Abstract9-14
• 前言14-18
• 材料與方法18-31
• 結(jié)果31-37
• 討論37-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-52
• 綜述：PD-1 在移植免疫耐受中的作用及應(yīng)用研究進(jìn)展52-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 附錄63-64
• 個人簡歷64-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文65

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳海競;張光波;胡玉敏;明志君;張學(xué)光;;PD-1在器官移植患者T細(xì)胞上的表達(dá)及其意義[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2008年10期

  本文關(guān)鍵詞：PD-L1高表達(dá)的大鼠髓源性樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：461415