發(fā)布時間：2017-06-12 21:01

  本文關(guān)鍵詞：HIV-1中和抗體的篩選與單價抗體的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：廣譜中和抗體就是能夠中和一種病毒的很多不同毒株的抗體,在預(yù)防和治療病毒感染中起到非常重要的作用,成為預(yù)防HIV的第一道防線。因此尋找具有廣譜中和活性的單克隆抗體一直是HIV-1治療和疫苗研究的一個重要方向。近年來隨著B細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的突破和改進(jìn),從HIV感染者中分離獲得廣譜中和抗體的概率和數(shù)量大大提高。例如分離的VRC01類抗體、PT系列和PGT系列抗體能中和目前世界范圍內(nèi)流行的大多數(shù)毒株,尤其是VRC01類抗體能中和90%以上的世界流行株。本研究采集HIV-1感染者抗凝全血,分離出外周血單個核細(xì)胞,用磁珠分選純化記憶性B細(xì)胞,在體外用hCD40L-3T3作為飼養(yǎng)細(xì)胞并使用細(xì)胞因子IL-2和IL-21誘導(dǎo)記憶性B細(xì)胞分泌IgG,用HIV假病毒微量中和的方法做篩選。從有中和活性的孔中分別擴(kuò)增出B細(xì)胞IgG的輕鏈和重鏈基因,并將其克隆到含IgG恒定區(qū)基因的載體上。然后將攜帶重鏈和輕鏈基因的質(zhì)粒進(jìn)行大量表達(dá),得到人單克隆抗體,并進(jìn)行抗體結(jié)合活性、中和活性及與抗原gp120親和力的鑒定。結(jié)果從我國3例HIV-1感染者記憶性B細(xì)胞中篩選出3株對HIV-1Env抗原有結(jié)合活性的單克隆抗體。其中8E7和55B3主要與gp120結(jié)合,19GF3與gp120和FLSC均可結(jié)合且結(jié)合活性無明顯差異;基因變異大的8E7抗體對A、B、C三種亞型的假病毒均有一定的中和活性,55B3對SF162有中和活性,19GF3未檢測到中和活性;這三種單抗的親和力都很強(qiáng),對Gp120蛋白的親和力達(dá)到8E7、19GF3、55B3對Gp120蛋白的親和力分別達(dá)到6.45×10-10 mol/L、1.12×10-10 mol/L、2.76×10-10 mol/L。在HIV的包膜表面刺突的分布非常稀疏,中和抗體的兩個抗原結(jié)合表位很難同時結(jié)合到一個病毒顆粒上的兩個刺突來發(fā)揮中和作用,也就是說兩個抗原結(jié)合表位很多時候只有一個能發(fā)揮作用。為了更好克服空間位阻,讓所有抗體的Fab都能發(fā)揮作用,本實(shí)驗(yàn)室在前期構(gòu)建了半分子型單價抗體(IgG half molecule,IgG-HM),初步的研究結(jié)果表明半分子型單價抗體與親本IgG抗體的中和活性相比有所提高,本研究對前期已構(gòu)建的單價抗體的中和活性做了更系統(tǒng)的檢測,并對ADCC活性的發(fā)揮以及抗體在體內(nèi)的半衰期進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,在單獨(dú)應(yīng)用時單價抗體的中和活性與IgG比較有明顯的提高,其中VRC01抗體提高的幅度最大,有3.74倍的提高。在對這三種單抗進(jìn)行兩兩組合對不同假病毒進(jìn)行的體外中和實(shí)驗(yàn)中,HM型單價抗體對病毒的中和活性明顯強(qiáng)于其原型IgG組合,主要表現(xiàn)在HM型抗體組合的IC80值普遍低于對應(yīng)的IgG組合;對于很難中和的病毒THRO.c/2626,兩種單價抗體組合(NIH45-46-HM與PG9-HM抗體、NIH45-46-HM與VRC01-HM)均檢測到明顯的中和活性,而對應(yīng)的IgG組合則未檢測到中和活性;三種單價抗體聯(lián)合應(yīng)用時IC80值明顯低于兩種抗體的組合。另外,我們以2G12抗體為模型,比較了在IgG或HM型單價抗體介導(dǎo)的NK細(xì)胞對Gp120蛋白負(fù)載的CEM-NK’-CCR5細(xì)胞的殺傷活性,結(jié)果顯示,IgG抗體有明顯的ADCC活性,但改造后的HM抗體ADCC活性喪失。但對改造前后的抗體在小鼠體內(nèi)的半衰期的比較結(jié)果顯示,單價抗體半衰期與原型IgG相比無明顯變化,說明HM型單價抗體雖然分子較小,但并未很快被清除,這與較小的抗體分子Fab和scFv在體內(nèi)很快被清除的特性有很大的差異,在實(shí)際應(yīng)用中也更有優(yōu)勢。在此基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了新篩選出的3株對HIV-1 Env抗原有結(jié)合活性的單克隆抗體(8E7、55B3和19GF3)的單價抗體,并對其結(jié)合活性和中和活性進(jìn)行了研究。體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明構(gòu)建的單價抗體與親本單克隆抗體在結(jié)合活性方面無明顯差異。在中和活性上,我們分別在體外不同的假病毒進(jìn)行了體外中和試驗(yàn),檢測其IC50值。結(jié)果顯示,8E7抗體能中和的病毒,HM型(IgG half molecule,IgG-HM)大多數(shù)也能中和,表明了單價抗體基本保持了親本抗體的中和活性。綜上所述,我們成功建立了在96孔板中高效刺激人B細(xì)胞在體外分泌IgG的方法,并利用HIV假病毒微量中和實(shí)驗(yàn)和RT-PCR技術(shù)篩選得到了對HIV-1具有中和活性的人單克隆抗體。此方法不僅應(yīng)用于HIV中和抗體的篩選,對其他感染者疾病的人單克隆抗體的篩選領(lǐng)域也有很好的應(yīng)用前景。我們的結(jié)果還提示在兩種或多種抗體聯(lián)合應(yīng)用中,單價抗體與二價IgG分子相比能更好地發(fā)揮兩種抗體的中和作用,為HIV-1感染的抗體治療提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1 單克隆抗體 半分子型單價抗體 中和活性
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 主要英文縮寫詞4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第1章 緒論13-21
• 1.1 HIV的概況13-14
• 1.2 中和抗體的作用及作用機(jī)制14-15
• 1.3 HIV中和抗體篩選方法15-16
• 1.4 HIV廣譜中和抗體研究進(jìn)展16-17
• 1.5 單價抗體的研究進(jìn)展17-18
• 1.6 本研究的內(nèi)容和意義18-21
• 第2章 利用B細(xì)胞培養(yǎng)和RT-PCR技術(shù)篩選具有廣譜中和活性的人單克隆抗體21-41
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 細(xì)胞和血樣21
• 2.1.2 假病毒21
• 2.1.3 主要材料21-22
• 2.1.4 儀器與設(shè)備22
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑配制22-23
• 2.2 方法23-33
• 2.2.1 HIV-1 感染者血漿中和活性檢測23-24
• 2.2.2 記憶性B細(xì)胞的分選和活化培養(yǎng)24-25
• 2.2.3 HIV微量中和實(shí)驗(yàn)25
• 2.2.4 ELISA方法檢測HIV-1Env特異性抗體25
• 2.2.5 抗體基因的擴(kuò)增和篩選25-30
• 2.2.6 抗體基因的序列分析30
• 2.2.7 單克隆抗體的制備和純化30-32
• 2.2.8 單克隆抗體活性的檢測32-33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-39
• 2.3.1 長期不進(jìn)展者血漿對不同亞型假病毒的中和活性33-34
• 2.3.2 記憶性B細(xì)胞刺激培養(yǎng)后的形態(tài)和IgG分泌量34-35
• 2.3.3 B細(xì)胞培養(yǎng)上清的中和試驗(yàn)35
• 2.3.4 記憶性Ｂ細(xì)胞培養(yǎng)上清中Env特異性抗體產(chǎn)生情況35
• 2.3.5 抗體重鏈可變區(qū)基因與輕鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增35-36
• 2.3.6 抗體基因序列分析36-37
• 2.3.7 陽性單克隆抗體與Env的結(jié)合活性37-38
• 2.3.8 陽性單克隆抗體中和活性分析38
• 2.3.9 陽性單克隆抗體抗體親和力檢測38-39
• 2.4 討論39
• 2.5 本章小結(jié)39-41
• 第3章 單價抗體的構(gòu)建及活性分析41-53
• 3.1 材料41-42
• 3.1.1 細(xì)胞和樣品41
• 3.1.2 主要試劑41-42
• 3.2 方法42-45
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-50
• 3.3.1 單價抗體的活性檢測45-48
• 3.3.2 篩選到的3株抗體其單價抗體的構(gòu)建及活性分析48-50
• 3.4 討論50-51
• 3.5 本章小結(jié)51-53
• 結(jié)論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文59-61
• 致謝61

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 齊劍英;郭茉;葉賢龍;闞方明;張宇;郝智超;徐黎明;任桂萍;王文飛;李德山;;scBsAb1/17雙特異性抗體對小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的治療效果[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2013年03期

2 ;[J];;年期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉雪;HIV-1中和抗體的篩選與單價抗體的研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2016年

2 馮一帆;HIV-1單價抗體的構(gòu)建與活性分析[D];北京工業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：HIV-1中和抗體的篩選與單價抗體的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：444882