本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌DnaJ調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)是一種革蘭陽性的條件致病菌,能夠引起腦膜炎、敗血癥和社區(qū)獲得性肺炎等多種侵襲性疾病。耐藥菌的廣泛出現(xiàn)使得疫苗預(yù)防成為控制S.pn感染的有效策略。肺炎鏈球菌DnaJ是一種與S.pn毒力相關(guān)的熱休克蛋白(heat shock protein, Hsp),屬于Hsp40家族,作為疫苗經(jīng)鼻腔或腹腔免疫小鼠,能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生S.pn感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答,但是其具體免疫應(yīng)答機(jī)制不清。研究DnaJ誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制有助于Spn疫苗的研發(fā)。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)是已知的最有效的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC),在抗病原體的固有免疫和適應(yīng)性免疫中都發(fā)揮重要作用。在其他細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)多種熱休克蛋白可以活化DC。最近在S.pn中也發(fā)現(xiàn),Hsp100/C1pP可以被Toll-樣受體4(Toll-like reseptor 4, TLR4)識(shí)別,通過活化MAPK和NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)DC活化和成熟,從而啟動(dòng)Thl免疫應(yīng)答。然而,作為一種熱休克蛋白,肺炎鏈球菌DnaJ能否誘導(dǎo)DC的成熟、介導(dǎo)DC成熟的分子機(jī)制,以及對(duì)T細(xì)胞的極化情況還未見報(bào)道。在本研究中,我們旨在研究肺炎鏈球菌DnaJ介導(dǎo)DC成熟的效能及其誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制。方法1.利用大腸桿菌原核表達(dá)DnaJ重組蛋白(recombinant DnaJ, rDnaJ)純化并去除LPS。2.研究rDnaJ蛋白誘導(dǎo)DC活化的機(jī)制(1) rDnaJ蛋白作用于小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測(cè)BMDC上MHCⅡ、CD86、CD40的表達(dá)；ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α IL-6和IL-12p40的分泌情況。(2) rDnaJ蛋白刺激TLR2 KO、TLR4 KO小鼠和WT小鼠來源的BMDC后,FCM檢測(cè)MHCⅡ、CD86、CD40的表達(dá)；ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的分泌情況。(3) 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)和磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)抑制劑抑制劑預(yù)處理BMDC后,ELISA檢測(cè)rDnaJ其對(duì)TNF-α和IL-6分泌的影響；Western blot檢測(cè)MAPK、NF-kB和Akt的磷酸化水平。3.研究rDnaJ蛋白誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制(1) 體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rDnaJ蛋白活化的BMDC在促進(jìn)T細(xì)胞分化中的作用。rDnaJ蛋白刺激后的DC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)36h,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-4口IL-17A的表達(dá)；FCM分別檢測(cè)IFN-γ+CD4+、IL-4+CD4+和IL-17A+CD4+細(xì)胞的百分比。(2) 過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rDnaJ蛋白活化的BMDC在促進(jìn)T細(xì)胞分化中的作用。分別在第0、14和28d,將rDnaJ蛋白刺激后的BMDC經(jīng)腹腔過繼轉(zhuǎn)移到WT小鼠體內(nèi)。取小鼠脾細(xì)胞,在體外經(jīng)rDnaJ蛋白再次刺激36h后,ELISA檢測(cè)脾細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。(3) 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR2和TLR4在誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答中的作用將WT、TLR2 KO小鼠和TLR4 KO小鼠各分為3組：CT+rDnaJ蛋白組、CT組和PBS組。在第0、7和14d免疫小鼠后,用rDnaJ蛋白刺激免疫小鼠脾細(xì)胞3d后,ELISA檢測(cè)IFN-γ、 IL-4和IL-17A水平。結(jié)果1.成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-deal,誘導(dǎo)表達(dá)后獲得了高純度的rDnaJ蛋白；并且采用PmB-agarose去除蛋白溶液中的LPS,使LPS殘留量不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.成功培養(yǎng)了小鼠BMDC,其純度達(dá)80%以上。3. rDnaJ蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠BMDC成熟,促使BMDC高表達(dá)細(xì)胞表面分子(MHCII、CD86和CD40)以及分泌細(xì)胞因子TNF-α IL-6和IL-12p40。4. rDnaJ蛋白通過TLR4受體誘導(dǎo)小鼠BMDC成熟,與TLR2無關(guān)。5. rDnaJ蛋白通過p38、ERK、JNK、PI3K-Akt和NF-κB等信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠BMDC成熟。6. rDnaJ蛋白通過TLR4刺激成熟的小鼠BMDC使初始CD4-T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞極化,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Thl和Th17型免疫應(yīng)答。結(jié)論本研究表明rDnaJ蛋白能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的BMDC免疫應(yīng)答,該免疫應(yīng)答是通過TLR4受體而不是TLR2受體、在MAPK、PI3K-Akt和NF-κB多條信號(hào)通路的參與下完成的。成熟BMDC可以使初始T細(xì)胞向Thl和Th17極化,引起宿主產(chǎn)生Thl和Th17型免疫應(yīng)答。本研究初步闡明了肺炎鏈球菌DnaJ蛋白引起宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制,為肺炎鏈球菌DnaJ蛋白作為蛋白疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：肺炎鏈球菌 DnaJ 樹突狀細(xì)胞 T細(xì)胞應(yīng)答
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 第一部分 肺炎鏈球菌rDnaJ蛋白的表達(dá)和純化18-25
• 1 實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 2 實(shí)驗(yàn)方法20-22
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-24
• 4 討論24-25
• 第二部分 肺炎鏈球菌DnaJ誘導(dǎo)BMDC免疫應(yīng)答的機(jī)制25-35
• 1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-28
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-33
• 4 討論33-35
• 第三部分 DnaJ蛋白在誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用35-42
• 1 實(shí)驗(yàn)材料35
• 2 實(shí)驗(yàn)方法35-37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-41
• 4 討論41-42
• 全文總結(jié)42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 文獻(xiàn)綜述46-53
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 致謝53-54
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文題錄54

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 CQS;美國(guó)耐多藥肺炎鏈球菌的發(fā)生率提高[J];中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào);2001年06期

2 鄔碩平,楊美云,蔣泓宇;警惕肺炎鏈球菌引起的老年腦膜炎[J];上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志;2002年03期

3 張雪梅;肺炎鏈球菌自然轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);2002年06期

4 宋琳,瞿介明;肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的研究進(jìn)展[J];中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2003年05期

5 彭燕,徐永濤;菌落形態(tài)發(fā)生變異的肺炎鏈球菌的鑒定[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2004年02期

6 周忠華,劉華,喻華;69株肺炎鏈球菌的體外抗菌藥物活性研究[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);2004年03期

7 徐禮鋒;鄭雪輝;祝進(jìn);陳芳建;陸軍;;52株肺炎鏈球菌耐藥性分析[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);2006年01期

8 孫端陽;施金玲;蔡璇;;126株肺炎鏈球菌臨床菌株的耐藥率分析[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2006年02期

9 黃曉群;龐棟;;肺炎鏈球菌的檢驗(yàn)技術(shù)及其進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)文選;2006年04期

10 邱付蘭;鐘榮榮;;77例肺炎鏈球菌的分布及藥敏分析[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);2007年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周忠華;劉華;喻華;;69株肺炎鏈球菌的體外抗菌藥物活性研究[A];中華醫(yī)院管理學(xué)會(huì)第十一屆全國(guó)醫(yī)院感染管理學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2004年

2 唐恒;陳勃江;李為民;;219株呼吸道肺炎鏈球菌的分離及耐藥性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第12次全國(guó)內(nèi)科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

3 張媛媛;王一雯;孫勝利;賀建平;;耐青霉素性肺炎鏈球菌致急性化膿性腦膜炎1例[A];第九屆西北五省（區(qū)）檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

4 胡惠麗;胡翼云;何樂健;沈敘莊;高薇;楊永弘;;肺炎鏈球菌在兒童社區(qū)獲得性肺炎死亡病例中致病地位的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十四次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

5 胡慶豐;呂火祥;沃銘毅;;53例呼吸道分離的肺炎鏈球菌耐藥性分析[A];2007年浙江省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2007年

6 吳佳學(xué);季海生;朱德全;;兒科痰培養(yǎng)肺炎鏈球菌耐藥分析對(duì)臨床的指導(dǎo)作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

7 高薇;姚開虎;俞桑潔;楊永弘;;2000～2005年分離自北京兒童鼻咽部的19群肺炎鏈球菌的耐藥性變化[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國(guó)兒科中青年學(xué)術(shù)交流大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2008年

8 余素飛;厲世笑;傅鷹;陳慧紅;朱海燕;陳文嫻;張慧娜;;肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥機(jī)制研究[A];2011年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2011年

9 黃小翠;崔亞利;;兒童使用的肺炎鏈球菌疫苗研究進(jìn)展[A];第一次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)論文匯編[C];2014年

10 黃勇;萬根平;顧曉瓊;鄧秋連;梁柳;鐘華敏;;廣州地區(qū)兒童感染肺炎鏈球菌耐藥相關(guān)基因的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 北京兒童醫(yī)院微生物免疫室 姚開虎;接種哪種肺炎鏈球菌疫苗好[N];健康報(bào);2007年

2 鄧力;肺炎鏈球菌易攻擊小孩和老人[N];健康報(bào);2007年

3 記者 王丹;兒童肺炎鏈球菌性疾病防治指南發(fā)布[N];健康報(bào);2010年

4 周密;山羊可能感染了肺炎鏈球菌病[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2010年

5 記者 吳偉農(nóng);美科學(xué)家繪制出肺炎鏈球菌基因圖譜[N];新華每日電訊;2001年

6 本報(bào)記者 李穎;肺炎鏈球菌遇流感病毒危害更大[N];科技日?qǐng)?bào);2010年

7 衛(wèi)生部北京醫(yī)院 張秀珍;肺炎鏈球菌對(duì)青霉素耐藥率上升快[N];健康報(bào);2008年

8 中華醫(yī)學(xué)會(huì)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)主任委員 曾光;秋冬季請(qǐng)呵護(hù)好“呼吸大道”[N];健康報(bào);2010年

9 北京兒童醫(yī)院呼吸科 劉金榮邋姚開虎 趙順英;小兒肺炎為何難愈[N];健康報(bào);2007年

10 記者 毛黎;遨游天宇的特殊客[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

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本文編號(hào)：413773