本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌DnaJ調(diào)節(jié)樹突狀細胞誘導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答的分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)是一種革蘭陽性的條件致病菌,能夠引起腦膜炎、敗血癥和社區(qū)獲得性肺炎等多種侵襲性疾病。耐藥菌的廣泛出現(xiàn)使得疫苗預(yù)防成為控制S.pn感染的有效策略。肺炎鏈球菌DnaJ是一種與S.pn毒力相關(guān)的熱休克蛋白(heat shock protein, Hsp),屬于Hsp40家族,作為疫苗經(jīng)鼻腔或腹腔免疫小鼠,能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生S.pn感染的保護性免疫應(yīng)答,但是其具體免疫應(yīng)答機制不清。研究DnaJ誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的機制有助于Spn疫苗的研發(fā)。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是已知的最有效的專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cell, APC),在抗病原體的固有免疫和適應(yīng)性免疫中都發(fā)揮重要作用。在其他細菌中發(fā)現(xiàn)多種熱休克蛋白可以活化DC。最近在S.pn中也發(fā)現(xiàn),Hsp100/C1pP可以被Toll-樣受體4(Toll-like reseptor 4, TLR4)識別,通過活化MAPK和NF-κB信號通路誘導(dǎo)DC活化和成熟,從而啟動Thl免疫應(yīng)答。然而,作為一種熱休克蛋白,肺炎鏈球菌DnaJ能否誘導(dǎo)DC的成熟、介導(dǎo)DC成熟的分子機制,以及對T細胞的極化情況還未見報道。在本研究中,我們旨在研究肺炎鏈球菌DnaJ介導(dǎo)DC成熟的效能及其誘導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答的機制。方法1.利用大腸桿菌原核表達DnaJ重組蛋白(recombinant DnaJ, rDnaJ)純化并去除LPS。2.研究rDnaJ蛋白誘導(dǎo)DC活化的機制(1) rDnaJ蛋白作用于小鼠骨髓來源樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)流式細胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測BMDC上MHCⅡ、CD86、CD40的表達；ELISA檢測細胞因子TNF-α IL-6和IL-12p40的分泌情況。(2) rDnaJ蛋白刺激TLR2 KO、TLR4 KO小鼠和WT小鼠來源的BMDC后,FCM檢測MHCⅡ、CD86、CD40的表達；ELISA檢測細胞因子TNF-α和IL-6的分泌情況。(3) 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)和磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)抑制劑抑制劑預(yù)處理BMDC后,ELISA檢測rDnaJ其對TNF-α和IL-6分泌的影響；Western blot檢測MAPK、NF-kB和Akt的磷酸化水平。3.研究rDnaJ蛋白誘導(dǎo)T細胞的免疫應(yīng)答機制(1) 體外實驗檢測rDnaJ蛋白活化的BMDC在促進T細胞分化中的作用。rDnaJ蛋白刺激后的DC與CD4+T細胞共培養(yǎng)36h,ELISA檢測培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-4口IL-17A的表達；FCM分別檢測IFN-γ+CD4+、IL-4+CD4+和IL-17A+CD4+細胞的百分比。(2) 過繼轉(zhuǎn)移實驗檢測rDnaJ蛋白活化的BMDC在促進T細胞分化中的作用。分別在第0、14和28d,將rDnaJ蛋白刺激后的BMDC經(jīng)腹腔過繼轉(zhuǎn)移到WT小鼠體內(nèi)。取小鼠脾細胞,在體外經(jīng)rDnaJ蛋白再次刺激36h后,ELISA檢測脾細胞上清中IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。(3) 體內(nèi)實驗檢測TLR2和TLR4在誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答中的作用將WT、TLR2 KO小鼠和TLR4 KO小鼠各分為3組：CT+rDnaJ蛋白組、CT組和PBS組。在第0、7和14d免疫小鼠后,用rDnaJ蛋白刺激免疫小鼠脾細胞3d后,ELISA檢測IFN-γ、 IL-4和IL-17A水平。結(jié)果1.成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)-deal,誘導(dǎo)表達后獲得了高純度的rDnaJ蛋白；并且采用PmB-agarose去除蛋白溶液中的LPS,使LPS殘留量不影響后續(xù)實驗。2.成功培養(yǎng)了小鼠BMDC,其純度達80%以上。3. rDnaJ蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠BMDC成熟,促使BMDC高表達細胞表面分子(MHCII、CD86和CD40)以及分泌細胞因子TNF-α IL-6和IL-12p40。4. rDnaJ蛋白通過TLR4受體誘導(dǎo)小鼠BMDC成熟,與TLR2無關(guān)。5. rDnaJ蛋白通過p38、ERK、JNK、PI3K-Akt和NF-κB等信號通路誘導(dǎo)小鼠BMDC成熟。6. rDnaJ蛋白通過TLR4刺激成熟的小鼠BMDC使初始CD4-T細胞向Th1和Th17細胞極化,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Thl和Th17型免疫應(yīng)答。結(jié)論本研究表明rDnaJ蛋白能夠誘導(dǎo)強烈的BMDC免疫應(yīng)答,該免疫應(yīng)答是通過TLR4受體而不是TLR2受體、在MAPK、PI3K-Akt和NF-κB多條信號通路的參與下完成的。成熟BMDC可以使初始T細胞向Thl和Th17極化,引起宿主產(chǎn)生Thl和Th17型免疫應(yīng)答。本研究初步闡明了肺炎鏈球菌DnaJ蛋白引起宿主免疫應(yīng)答的機制,為肺炎鏈球菌DnaJ蛋白作為蛋白疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：肺炎鏈球菌 DnaJ 樹突狀細胞 T細胞應(yīng)答
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 第一部分 肺炎鏈球菌rDnaJ蛋白的表達和純化18-25
• 1 實驗材料18-20
• 2 實驗方法20-22
• 3 實驗結(jié)果22-24
• 4 討論24-25
• 第二部分 肺炎鏈球菌DnaJ誘導(dǎo)BMDC免疫應(yīng)答的機制25-35
• 1 實驗材料25-26
• 2 實驗方法26-28
• 3 實驗結(jié)果28-33
• 4 討論33-35
• 第三部分 DnaJ蛋白在誘導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答中的作用35-42
• 1 實驗材料35
• 2 實驗方法35-37
• 3 實驗結(jié)果37-41
• 4 討論41-42
• 全文總結(jié)42-43
• 參考文獻43-46
• 文獻綜述46-53
• 參考文獻49-53
• 致謝53-54
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文題錄54

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7 衛(wèi)生部北京醫(yī)院 張秀珍;肺炎鏈球菌對青霉素耐藥率上升快[N];健康報;2008年

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本文編號：413773