本文關鍵詞：β1整合素的表達純化及在篩查幽門螺桿菌與之結合蛋白中的應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)近年來被認為是一種兼性胞內菌,它不僅能侵入細胞,而且可在細胞內繁殖和產生毒素。已有研究證實,Hp可通過細胞表面的β1整合素介導而侵入胃上皮細胞,但與此相關的細菌蛋白及其相應作用目前尚不清楚。本課題旨在通過原核表達純化技術,獲得可溶性的β1整合素蛋白。將制備好的β1整合素蛋白和本實驗室已構建好的Hp T7噬菌體展示c DNA文庫親和淘洗篩選,獲得與β1整合素相互作用的Hp蛋白DNA序列,為下一步研究和β1整合素相互作用的蛋白以及相關功能奠定基礎。方法①從GENBANK獲得β1整合素CDS區(qū)序列,保留β1整合素的胞外膜區(qū),截掉β1整合素的N端信號肽序列。②分析β1整合素的稀有密碼子分布情況,優(yōu)化β1整合素的稀有密碼子。參照β1整合素的m RNA二級結構,優(yōu)化TIR的密碼子。③全基因合成β1整合素序列并插入到克隆載體p UC18。分別將p UC18-β1-integrin質粒和p ET30a載體雙酶切,回收后的片段使用T4連接酶連接。④p ET30a-β1-integrin質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài),挑取陽性單克隆誘導表達并SDS-PAGE電泳分析其表達情況。⑤取保存的菌株誘導后超聲破菌收集上清,SDS-PAGE電泳分析蛋白的可溶性。⑥誘導細菌表達并收集包涵體,包涵體破碎和溶解后過Ni-NTA柱,用含不同濃度的咪唑洗脫液洗脫,收集各個濃度的洗脫液并SDS-PAGE電泳分析。⑦將溶解的蛋白裝入透析袋,先以復性液透析三次,再以蛋白貯存液透析三次,濾膜過濾后于冰箱凍存。⑧使用純化的β1整合素篩查Hp T7噬菌體展示c DNA文庫。挑取單個噬菌斑進行PCR反應,瓊脂糖電泳檢查PCR反應產物并回收,T7特異性引物進行測序分析。⑨將獲得的序列在NCBI(美國國立生物技術信息中心)Gen Bank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比較。結果①全基因合成的p UC18-β1-integrin質粒單酶切鑒定結果正確。②構建好的p ET30a-β1-integrin質粒測序結果正確。③p ET30a-β1-integrin質粒轉化BL21(DE3)后挑取單克隆誘導表達,SDS-PAGE結果得出在β1整合素分子量80k D附近有條帶。④SDS-PAGE分析蛋白可溶性得出,β1整合素在上清表達量很低,大部分以包涵體形式表達。⑤通過包涵體變性和復性得到可溶的β1整合素蛋白,其濃度為0.32mg/ml。Western blot使用his-tag抗體檢測目的蛋白,在其分子量80k D附近有條帶。SDS-PAGE檢測純化好的蛋白,在其分子量80k D附近有單一條帶。蛋白凍融實驗得出目的蛋白凍融后無懸浮物,離心后無明顯沉淀。⑥Hp T7噬菌體展示c DNA文庫篩選與β1整合素互相結合的蛋白,測序比對后得到2個與β1整合素結合的預選蛋白。結論①通過原核表達、純化技術,獲得可溶性、純度較高的β1整合素蛋白。②Hp T7噬菌體展示c DNA文庫篩選與β1整合素互相結合的蛋白,得到2個和β1整合素結合的預選蛋白。
【關鍵詞】：幽門螺桿菌 β1整合素 原核表達 純化 親和淘洗篩選
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 英文縮略語表4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-13
• 材料和方法13-25
• 結果25-34
• 討論34-38
• 結論38-39
• 參考文獻39-41
• 綜述41-48
• 參考文獻44-48
• 致謝48

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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  本文關鍵詞：β1整合素的表達純化及在篩查幽門螺桿菌與之結合蛋白中的應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：406431