本文關(guān)鍵詞：痢疾桿菌效應(yīng)蛋白調(diào)節(jié)宿主蛋白質(zhì)泛素化信號(hào)途徑的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：痢疾桿菌是細(xì)菌性痢疾的病原菌,它能夠利用自身毒性質(zhì)粒編碼的三型分泌系統(tǒng)向宿主細(xì)胞內(nèi)分泌效應(yīng)蛋白。效應(yīng)蛋白以宿主細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號(hào)分子為靶標(biāo),調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路,以利于痢疾桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖轉(zhuǎn)移。蛋白質(zhì)泛素化途徑是細(xì)胞內(nèi)極其重要的一個(gè)翻譯后修飾途徑,因此也常常被效應(yīng)蛋白作為攻擊目標(biāo)。本文以痢疾桿菌效應(yīng)蛋白OspI和IpaH3為研究對(duì)象,利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法,解析效應(yīng)蛋白調(diào)節(jié)宿主泛素化過(guò)程的分子機(jī)制。已有研究發(fā)現(xiàn)痢疾桿菌效應(yīng)蛋白OspI能夠使Ubc13的Gln100脫酰胺化,導(dǎo)致Ubc13失活,破壞了宿主細(xì)胞內(nèi)的NF-kB信號(hào)通路。IpaH3作為一個(gè)泛素連接酶,能夠特異地結(jié)合共價(jià)連接有泛素的UbcH5c,在下游底物上連接形成K48的泛素鏈。但是,OspI-Ubcl3與IpaH-UbcH5c間相互作用的分子機(jī)制仍是一個(gè)未解之謎。 本文通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了OspI及其宿主靶分子泛素結(jié)合酶Ubc13,并通過(guò)純化獲得二者的高純度重組蛋白,二者經(jīng)孵育后形成穩(wěn)定的效應(yīng)蛋白-宿主靶分子復(fù)合物。通過(guò)復(fù)合物結(jié)晶實(shí)驗(yàn),我們獲得了衍射分辨率為2.3埃的復(fù)合物晶體。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析,我們發(fā)現(xiàn)OspI通過(guò)兩個(gè)不同的表面電荷區(qū)與Ubc13的α1-螺旋、L1loop和L2loop相互作用,也進(jìn)一步揭示了OspI的脫酰胺酶催化機(jī)制。 另外,我們通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng),高效表達(dá)和純化獲得了IpaH3的重組蛋白,并且成功地在體外合成了Ub共價(jià)連接的泛素結(jié)合酶UbcH5c (UbcH5c-Ub)。然后,我們利用分子篩證明了IpaH3與UbcH5c-Ub之間的相互作用。在經(jīng)孵育后篩選,我們獲得了許多的結(jié)晶條件,從眾多條件中成功篩選到IpaH3-UbcH5c-Ub復(fù)合物晶體。接下來(lái)我們需要進(jìn)一步解析IpaH3-UbcH5c-Ub復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),進(jìn)而闡明二者之間的相互作用。
【關(guān)鍵詞】：痢疾桿菌 效應(yīng)蛋白 蛋白泛素化 結(jié)構(gòu)生物學(xué)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【目錄】：

• 致謝5-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 目錄10-13
• 第1章 緒論13-24
• 1.1 痢疾桿菌13-17
• 1.1.1 痢疾桿菌的發(fā)現(xiàn)及其致病性13-14
• 1.1.2 痢疾桿菌的感染過(guò)程14
• 1.1.3 痢疾桿菌的毒性質(zhì)粒14-15
• 1.1.4 痢疾桿菌的三型分泌系統(tǒng)15-16
• 1.1.5 痢疾桿菌效應(yīng)蛋白16-17
• 1.2 泛素化系統(tǒng)17-21
• 1.2.1 什么是蛋白泛素化途徑17-18
• 1.2.2 蛋白泛素化途徑的基本成分18-21
• 1.2.2.1 泛素(Ub)18-19
• 1.2.2.2 泛素激活酶(E1)19
• 1.2.2.3 泛素結(jié)合酶(E2)19-21
• 1.2.2.4 泛素連接酶(E3)21
• 1.3 痢疾桿菌效應(yīng)蛋白對(duì)蛋白泛素化途徑的調(diào)控21-24
• 1.3.1 痢疾桿菌效應(yīng)蛋白OspI21-22
• 1.3.2 痢疾桿菌效應(yīng)蛋白IpaH322-24
• 第2章 材料和方法24-43
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料24
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑24-25
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器25-26
• 2.2 方法26-43
• 2.2.1 常用試劑的配置26
• 2.2.2 分子克隆26-32
• 2.2.3 目的基因的鑒定32-34
• 2.2.4 蛋白的表達(dá)與純化34-38
• 2.2.5 蛋白之間相互作用的檢測(cè)38-39
• 2.2.6 E2～Ub的制備39
• 2.2.7 蛋白結(jié)晶39-41
• 2.2.8 數(shù)據(jù)的收集和處理41-43
• 第3章 結(jié)果和討論43-70
• 3.1 效應(yīng)蛋白OspI和Ubc13復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究43-54
• 3.1.1 OspI C62A突變體的表達(dá)純化43-45
• 3.1.1.1 OspI C62A的親和純化結(jié)果43
• 3.1.1.2 OspI C62A的進(jìn)一步純化結(jié)果43-45
• 3.1.2 Ubc13的表達(dá)純化45-47
• 3.1.2.1 Ubc13的親和純化結(jié)果45
• 3.1.2.2 Ubc13的進(jìn)一步純化結(jié)果45-47
• 3.1.3 OspI-Ubc13復(fù)合物晶體的篩選、優(yōu)化與衍射47-50
• 3.1.3.1 OspI-Ubc13復(fù)合物晶體的初步篩選及晶體優(yōu)化47-48
• 3.1.3.2 OspI-Ubc13復(fù)合物晶體的衍射結(jié)果48-50
• 3.1.4 OspI-Ubc13復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析50-54
• 3.1.4.1 OspI-Ubc13復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)50-51
• 3.1.4.2 OspI與Ubc13間的相互作用面51-52
• 3.1.4.3 OspI的催化機(jī)制52-53
• 3.1.4.4 OspI催化口袋的構(gòu)象變化53-54
• 3.2 效應(yīng)蛋白IpaH3和UbcH5c～Ub復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究54-70
• 3.2.1 IpaH3的表達(dá)純化54-56
• 3.2.2 UbcH5C～Ub的合成與純化56-61
• 3.2.3 IpaH3 CTD與UbcH5c～Ub間的相互作用檢測(cè)61-63
• 3.2.4 IpaH3與UbcH5c～Ub的結(jié)晶與優(yōu)化63-70
• 3.2.4.1 IpaH3 CTD與UbcH5c～Ub復(fù)合物晶體的初步篩選63-65
• 3.2.4.2 非復(fù)合物晶體的排除65-67
• 3.2.4.3 全長(zhǎng)IpaH3與UbcH5c-Ub復(fù)合物晶體的篩選及優(yōu)化67-70
• 結(jié)論70-72
• OspI與Ubc13的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究70
• IpaH3與UbcH5c～Ub的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究70-72
• 參考文獻(xiàn)72-77
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷77

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：402701